تولید پروتئین های نوترکیب در سیستم های یوکاریوتی
سیستم های بیان پروکاریوتی :
سیستم های بیان پروکاریوتی در تولید پروتئین های متعدد به خوبی عمل می کند، ولی برخی از پروتئین ها به پردازش های پس از ترجمه از قبیل گلیکوزیله شدن، فسفریله شدن و استیله شدن احتیاج دارند که باکتری ها قادر به انجام آن نمی باشند. به منظور حل این مشکل، برای بیان ژن های کلون شده از سلول های یوکاریوتی استفاده می شود.
سیستم های بیان های یوکاریوتی :
حامل های بیان یوکاریوتی با همان اهداف حامل های بیان پروکاریوتی طراحی می شود. از مخمر ساکارومایسز سرویزیه برای تولید چندین پروتئین مختلف از ژن های کلون شده استفاده شده است. این مخمر از نظر ژنتیکی کاملاً شناخته شده است و می تواند در فرمانتورهای بزرگ کشت داده شود. همچنین به منظور تسهیل در مرحله خالص سازی، حامل های ساکارومایسز سرویزیه ابداع شده است که به ترشح پروتئین های هترولوگ کمک می کنند.
پروتئین های واقعی متعددی در ساکارومایسز سرویزیه ساخته شده است. با این وجود زمانی که بخواهیم از ساکارومایسز به عنوان سلول میزبان استفاده کنیم، تعدادی از پروتئین های نوترکیب به خوبی پردازش نشده و مقدار پروتئین به دست آمده، اغلب کم است. این بود که سیستم های مخمر دیگری برای تولید پروتئین های نوترکیب ابداع شده است. به دنبال جستجو برای سایر سیستم های یوکاریوتی غیرقارچی که پروتئین هایی با فعالیت بیولوژیکی تولید کند، توجه دانشمندان به حامل های بیان باکلوویروس جلب شد.
سیستم بیانی باکلوویروس :
مثلاً باکلوویروس AcMNPV که سلولهای حشره را آلوده می کند، به عنوان یک حامل بیان یوکاریوتی ساخته شد که امیدهای زیادی را برانگیخت. روش اولیه از این قرار بود که یک سلول حشره آلوده شده با AcMNPV توسط یک حامل ناقل دارای ژن کلون شده و محصور شده با توالی های مختص به AcMNPV آلوده می شد. آنگاه طی یک کراس اور مضاعف بین حامل انتقال و ژنوم AcMNP۷ ژن کلون شده در ژنوم AcMNP۷ وارد شده و تحت کنترل راه انداز نیرومندی قرار می گرفت که طی مراحل نهایی چرخه لیز کننده فعال بود.
در چنین شرایطی با آلوده شدن سلولهای حشره توسط باکولوویروس نوترکیب، پروتئین هترولوگ ساخته می شد. میزان تولید باکولوویروس نوترکیب که با پروتکل اصلی کمتر از ۱٪ بود به حدود ۹۹٪ رسیده است. ACMNPV DNA تحت اثر اندونوکلئاز محدود کننده ای قرار می گیرد که DNA را در دو محل بخصوص برش داده و قسمتی از ژنوم را که شامل بخشی از یک ژن حیاتی برای چرخه لیز کننده است، بر می دارد. آنگاه سلول های حشره توسط DNA ویروسی تیمار شده آلوده می شود. سپس این سلول هاى آلوده را با یک حامل انتقالی آلوده می کنیم. در برخی سلول ها طی یک کراس آور مضاعف، ژنوم ACMNP۷ دوباره حلقوی می شود، در حالی که ژن کلون شده در شکل سالم و بازیابی شده ژن حیاتی در آن جای گرفته است. در نتیجه با تمام محدودیت هایی که در این تکنیک وجود دارد، تقریباً تمام باکولوویروس های ویروسی، نوترکیب هستند.
باسمید :
پیشرفت بعدی در سیستم بیان باکولوویروس، تولید حامل چندگانه «سلول حشره – E.coli (باسمید) بود که با این تکنیک می توان از E.coli به عنوان سلول میزبان برای انجام تمام دستکاری های ژنتیکی استفاده کرد. با این روش سلول های حشره تنها زمانی با باسمید نوترکیب آلوده می شوند که به پروتئین هترولوگ نیاز است. حدود ۹۵٪ از مجموع پروتئین های ساخته شده سیستم بیان باکولوویروس، تحت پردازش های پس از ترجمه مناسب قرار گرفت. از حامل های بیان خارج کروموزومی در پستانداران عموماً در پروژه های تحقیقاتی و آزمایشات بالینی استفاده می شود. حامل های بیان پستانداران، حامل هایی چندگانه هستند که منشأهای همانندسازی آنها از یک ویروس انسانی و یک پلاسمید بر مبنای پلاسمیدهای E. coli ساخته شده است. همچنین عناصر تنظیم کننده واحدهای رونویسی از ویروس های حیوانی یا ژن های پستانداران گرفته شده است.
سیستم های ژن نشانگر انتخابی غالب، در انتخاب سلول های آلایش شده کاربرد دارد. در برخی از این سیستم ها، مثل سیستم DHFR-MTX میتوان با افزایش مقدار ترکیبات دارای سمیت سلولی در محیط کشت، سلول هایی را انتخاب کرد که تعداد نسخه های بیشتری از حامل دارد و در نتیجه، مقدار پروتئین هترولوگ به دست آمده را افزایش داد.
سیستم های بیانی در سلول های پستانداران :
دو سیستم بیان درون سلولی در پستانداران به منظور تولید پروتئین های دارای دو زیر واحد مختلف، ابداع شده می باشد. با آلوده کردن همزمان سلول میزبان با دو حامل که هر یک، ژن مربوط به یکی از زیر واحدها را حمل می کند، میتوان پروتئین های دو زنجیره ای و چهار زنجیره ای را ساخته و سرهم نمود. دستاوردهای جدید بر استفاده از یک حامل مبتنی است که دو ژن را به عنوان دو واحد رونویسی جداگانه حمل می کند (حامل دو کاسته) و یا واحد رونویسی منفردى که شامل دوژن (حامل دی سیسترونیک) می شود که یکی از پروتئین ها از انتهای5 مولکول mRNA و دیگری از یک IRES ترجمه می شود.
نویسنده : سعید کارگر
تولید پروتئین های نوترکیب در سیستم های یوکاریوتی
تولید پروتئین های نوترکیب در سیستم های یوکاریوتی
تولید پروتئین های نوترکیب در سیستم های یوکاریوتی
تولید پروتئین های نوترکیب در سیستم های یوکاریوتی
