کسب و کارهای فعال در داده‌های زیستی حمایت شدند رییس مرکز فناوری‌های همگرا معاونت علمی از حمایت‌ها و اقدامات لازم برای توسعه کسب و کارها در حوزه داده‌های زیستی خبر داد و گفت: تنها راه توسعه بازار این حوزه در کشور، جلوگیری از خروج نمونه‌ها به خارج است. به گزارش پایگاه اطلاع‌رسانی دولت به نقل از معاونت علمی و فناوری ریاست جمهوری، نسل جدید توالی‌یابی (NGS) یکی از حوزه‌های همگرایی است که توسعه آن از برنامه‌های مرکز فناوری‌های همگرا معاونت علمی است. علی محمد سلطانی رییس مرکز فناوری‌های همگرا معاونت علمی گفت: نسل جدید توالی‌یابی به مجموعه فناوری‌هایی گفته می‌شود که می‌توانند حجم زیادی از DNA را در مدت‌زمانی کوتاه و با هزینه کم توالی‌یابی کنند.

کسب و کارهای فعال در داده‌های زیستی حمایت شدند

رییس مرکز فناوری‌های همگرا معاونت علمی از حمایت‌ها و اقدامات لازم برای توسعه کسب و کارها در حوزه داده‌های زیستی خبر داد و گفت: تنها راه توسعه بازار این حوزه در کشور، جلوگیری از خروج نمونه‌ها به خارج است.

به گزارش سایت مهندسی علوم زیستی به نقل از معاونت علمی و فناوری ریاست جمهوری، نسل جدید توالی‌یابی (NGS) یکی از حوزه‌های همگرایی است که توسعه آن از برنامه‌های مرکز فناوری‌های همگرا معاونت علمی است.

کسب و کارهای فعال در داده‌های زیستی حمایت شدند رییس مرکز فناوری‌های همگرا معاونت علمی از حمایت‌ها و اقدامات لازم برای توسعه کسب و کارها در حوزه داده‌های زیستی خبر داد و گفت: تنها راه توسعه بازار این حوزه در کشور، جلوگیری از خروج نمونه‌ها به خارج است. به گزارش پایگاه اطلاع‌رسانی دولت به نقل از معاونت علمی و فناوری ریاست جمهوری، نسل جدید توالی‌یابی (NGS) یکی از حوزه‌های همگرایی است که توسعه آن از برنامه‌های مرکز فناوری‌های همگرا معاونت علمی است. علی محمد سلطانی رییس مرکز فناوری‌های همگرا معاونت علمی گفت: نسل جدید توالی‌یابی به مجموعه فناوری‌هایی گفته می‌شود که می‌توانند حجم زیادی از DNA را در مدت‌زمانی کوتاه و با هزینه کم توالی‌یابی کنند.
کسب و کارهای فعال در داده‌های زیستی حمایت شدند

علی محمد سلطانی رییس مرکز فناوری‌های همگرا معاونت علمی گفت: نسل جدید توالی‌یابی به مجموعه فناوری‌هایی گفته می‌شود که می‌توانند حجم زیادی از DNA را در مدت‌زمانی کوتاه و با هزینه کم توالی‌یابی کنند. با توجه به اینکه در این حوزه تحقیقات در دنیا به سرعت در حال انجام است، اقداماتی را برای گسترش آن انجام دادیم. انتشار فراخوان حمایت از کسب‌وکارهای داده‌های زیستی نخستین اقدام این مرکز در این حوزه است. در این فراخوان که با همکاری ستاد توسعه زیست‌فناوری معاونت علمی منتشر شد، هم‌اکنون ۳ گروه با حمایت‌ها و پیگیری‌های لازم فعالیت‌های خود را دنبال می‌کنند و در حال توسعه محصول و کسب‌وکار خود هستند.

وی همچنین حمایت برای تولید و تجاری‌سازی کیت cell free DNA را اقدامی دیگر از مرکز همگرا در این حوزه دانست و افزود: این محصول برای نخستین بار در کشور با تلاش‌های انجام شده در یکی از شرکت‌های دانش بنیان تولید شد. آزمون‌های تأیید کیفیت آن در یکی از آزمایشگاه‌های ژنتیک پزشکی انجام شده است. این شرکت فناور در حال حاضر تعدادی از این کیت را وارد بازار کرده است و در سال جاری و با حمایت‌های بیشتر مرکز راهبردی فناوری همگرا حجم تولید و فروش خود را افزایش می‌دهد.

موانع گسترش کسب و کارهای داده‌های زیستی بررسی شد

سلطانی ادامه داد: مطالعه و بررسی موانع گسترش کسب‌وکارهای حوزه داده های زیستی در کشور اقدام دیگر مرکز برای توسعه این حوزه در کشور است. بررسی‌ها و مطالعات میدانی نشان داد که یکی از موانع اصلی شکل‌گیری کسب‌وکارهای این حوزه، خروج بی‌رویه نمونه‌ها به خارج از کشور است و تنها راه توسعه بازار آن در کشور، جلوگیری از خروج این نمونه‌ها است. در مورد این موضوع نیازمند سیاست‌ها و برنامه‌های تنظیم‌گری در سطح ملی و همچنین برنامه‌های توسعه فناوری و محصول در کنار هم هستیم.

وی در ادامه از اولویت‌ها سال جاری برای توسعه کسب و کارهای داده‌های زیستی گفت و بیان کرد: امسال دومین فراخوان حمایت از کسب‌وکارهای داده‌های زیستی برای راه‌اندازی کسب‌وکارهای جدید در دو بخش کیت‌ها و تحلیل داده منتشر می‌شود.

تشخیص SNP از طریق توالی یابی نسل جدید NGS | توالی یابی نسل جدید | توالی یابی کل ژنوم | توالی یابی | توالی یابی کل اگزون های ژنوم | اگزوم | توالی یابی اگزومی | اگزون | Massive Parallel Sequencing | کاربرد توالی یابی اگزومی | فنوتیپ های هتروژن

انواع توالی یابی نسل جدید | توالی یابی اگزومی و کاربردهای آن

از زمان ابداع و معرفی توالی یابی نسل جدید تاکنون پیشرفت های زیادی در خصوص کارایی، سرعت و بازده روش مزبور صورت گرفته که منجر به معرفی انواعی از این روش شده است

توالی یابی کل ژنوم (WGS)

در این روش کل توالی ژنومی یک موجود (ژنوم هسته ای به همراه DNA میتوکندریایی در سلول های جانوری و DNA کلروپلاست در سلول های گیاهی) توالی یابی می گردد. در این حالت حدود هزاران ژن فعال و نیز هزاران توالی خاموش به طور همزمان بررسی می شوند. روش WGS با پوشش دهی 98.5 درصدی توالی های کد کننده، یکی از کارآمدترین روش ها برای شناسایی جهش های ژنتیکی است.

مطالعه همبستگی ژنوم (GWAS) بر مبنای ریز ارائه از جمله پرکاربردترین روش های تشخیص جهش های مرتبط با بیماری هایی می باشد که در آن حدود 4 میلیون مارکر بیماری هایی می باشد که در آن حدود 4 میلیون مارکر در هر نمونه مورد بررسی قرار می گیرد. با این حال این رقم در مقابل شناسایی همزمان 3/2 میلیارد جفت باز در روش WGS عدد کوچکی محسوب می شود.

توالی یابی اگزومی (WES)

در حال حاضر، ماهیت درصد کمی از توالی ژنوم انسان مشخص شده است و اطلاعات بالینی محدودی را می توان بلافاصله از توالی ژنوم کامل یک بیمار به دست آورد. بنابراین، برای محققان بالینی مقرون به صرفه تر است که فقط توالی اگزونی (۲٪ از ژنوم نواحی رمز گذار پروتئین و یا اگزون است)، مندلیوم (نواحی مربوط به ۲۹۹۳ ژن کد کننده بیماری های شناخته شده) و یا قطعات ژنی بیماری زا را برای غربالگری جهش مربوطه در تشخیص و درمان بیماری هدف قرار دهند. از این روش می توان برای تشخیص مولکولی اختلالات مرتبط با گروهی از ژن ها استفاده نمود. بدین منظور، نیاز است تا ژن هدف برای جلوگیری از دخالت سایر نواحی باقی مانده از ژنوم، تا ده ها با هزاران بار بیشتر از میزان آن در ژنوم غنی شود.

توالی یابی کل اگزون های ژنوم (اگزوم)

در تشخیص های بالینی بسیار ارزشمند است و دیدی جامع از آرایش ژنتیکی یک بیماری ارائه می دهد. با جود آن که اگزون ها تنها ۲٪ از کل ژنوم را به خود اختصاص داده اند، اما در حدود ۸۵٪ از جهش های مولکول DNA که مسبب بسیاری از بیماری های ژنتیکی در انسان است را شامل می شوند . در واقع تعیین توالی اگزومی که اخیرا وارد تحقیقات ژنتیک پزشکی شده است، تا به حال نقش بیش از هزاران ژن را در اختلالات مندلی مشخص کرده است و این آمار به سرعت در حال رشد است.

مراحل توالی یابی اگزومی

نحوه انجام توالی یابی اگزومی بدین صورت است که در ابتدا DNA ژنومی به صورت تصادفی قطعه قطعه شده و سپس آداپتورها به کتابخانه حاصله متصل می شوند. سپس کتابخانه برای توالی های اگزونی غنی شده و در مرحله بعد، قطعات با RNA یا DNA بیوتینیله شده هیبرید شده و به دنبال آن تعیین توالی به صورت گسترده Massive Parallel Sequencing , MPS انجام گرفته و در نهایت داده های حاصله، تجزیه و تحلیل، نقشه برداری، تنظیم و خوانده می شوند (شکل ۲).

طریقه توالی یابی اگزومی | تشخیص SNP از طریق توالی یابی نسل جدید NGS | توالی یابی نسل جدید |  توالی یابی کل ژنوم  | توالی یابی | توالی یابی کل اگزون های ژنوم | اگزوم | توالی یابی اگزومی | اگزون | Massive Parallel Sequencing | کاربرد توالی یابی اگزومی | فنوتیپ های هتروژن
طریقه توالی یابی اگزومی

کاربرد توالی یابی اگزومی

مواردی که در آن توالی یابی اگزومی توصیه می شود عبارتند از: ۱) فنوتیپ های هتروژن (حالتی که در آن جهش در ژن های متعدد به تظاهرات بالینی یکسان منجر می شود، مانند عقب ماندگی ذهنی، تاخیر در رشد، کوتاهی قد، کاردیومیوپاتی، ناشنوایی، اختلالات متابولیک، بدشکلی های پیچیده، بیماری های عضلانی، نابینایی ارثی، بیماری های قلبی- عروقی و ..، ۲) فنوتیپ های کاملا نامشخص و یا مجموعه ای از علائم که تشخیص افتراقی را با مشکل مواجه می کند و 3) ژن های بزرگ نظیر ژن دیستروفین.

مقالات مرتبط :

توالی یابی نسل جدید
تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنولوژی 454 | پایروسکوئنسینگ
تکنولوژی ABI / SOLD
تکنیک توالی یابی ۴۵۴

در شکل ۳ به عنوان مثال تشخیص بیماری زالی(آلبینیسم) با روش توالی یابی اگزومی نشان داده شده است. همانگونه که در شکل قسمت a و b دیده می شود، علائم مشاهده شده در فرد مراجعه کننده مشابه فنوتیپ معمول بیماران مبتلا به آلبينيسم نوع 4 است و لذا این بیماری برای فرد تشخیص داده می شود. شجره نامه فرد مذکور نیز در بخش به نشان داده شده است. نقاط نشاندار شده در آیدیو گرام قسمت d، نشان دهنده نواحی هموزیگوت در ژنوم این فرد هستند که با استفاده از روش آنالیز ارائه پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی شناسایی شدند. پس از این مرحله، نواحی هموزیگوت به روش توالی یابی اگزومی مورد بررسی قرار گرفتند و در نهایت دو جهش عامل بیماری آلبينيسم نوع 4 در این فرد شناسایی شد. قسمت کروماتوگرام حاصل از توالی یابی اگزومی را برای ژن SLC45A2 و قسمت f کروماتوگرام حاصل از توالی یابی اگزومی را برای ژن C6PC3 نشان می دهد که فرد برای هر دو حاوی جهش هموزیگوت است. این مثال اهمیت تکنیک NGS برای تائید صحت تشخیص بیماری را به خوبی به نشان می دهد .


تشخیص SNP از طریق توالی یابی نسل جدید NGS | توالی یابی نسل جدید |  توالی یابی کل ژنوم  | توالی یابی | توالی یابی کل اگزون های ژنوم | اگزوم | توالی یابی اگزومی | اگزون | Massive Parallel Sequencing | کاربرد توالی یابی اگزومی | فنوتیپ های هتروژن
تشخیص SNP از طریق توالی یابی نسل جدید NGS


تکنولوژی توالی یابی | Sequencing by oligonucleotide Ligation and detection | سیستم توالی یابی ۴۵۴ | Sequencing by ligation | آداپتور | Emulsion PCR | تعیین توالی | اکتامر | فلورسنت Sequencing error | توالی یابی چیست | تکنیک توالی یابی | sequencing | تکنیک‌های توالی یابی ژنوم | تکینک توالی یابی Sanger | توالی یابی DNA | تکنیک‌های توالی یابی نسل جدید | Next generation sequencing | توالی یابی نسل جدید | توالی یابی ۴۵۴ | توالی یابی Illumina | توالی یابی نسل سوم | تعیین توالی چیست | توالی یابی پایرو | روش های توالی یابی ژنوم | توالی یابی پروتئین | نسل جدید توالی یابی dna | توالی یابی rna | روش توالی یابی سنگر | تکنیک توالی یابی Sanger | تکنیک توالی یابی نسل جدید | تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنیک توالی یابی Illumina | تکنیک توالی یابی نسل سوم | مبانی بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک چیست . رشته بیو انفورماتیک . بیوانفورماتیک pdf . بیوانفورماتیک در ایران . رشته بیوانفورماتیک در ایران . بیوانفورماتیک به زبان ساده . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . کاربرد بیوانفورماتیک در بیوتکنولوژی ٬ مبانی بیوانفورماتیک . طراحی دارو چیست . کارگاه طراحی دارو ٬ . آموزش طراحی دارو ٬ طراحی واکسن ٬ نرم افزار های طراحی دارو ٬ طراحی دارو با کامپیوتر ٬ کتاب طراحی دارو ٬ بیوانفورماتیک pdf ٬ دانلود کتاب بیوانفورماتیک به زبان ساده فارسی . دانلود کتاب بیوانفورماتیک . دانلود رایگان کتاب بیوانفورماتیک به زبان فارسی . آموزش بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک دانشگاه تهران . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . سعید کارگر

تکنولوژی توالی یابی SOLID یا oligonucleotide Ligation and detection

تکنولوژی ABI / SOLID

شرکت Sequencing by oligonucleotide Ligation and detection یا SOLID در سال ۲۰۰۶، تکنولوژی توالی یابی از طریق اتصال (Sequencing by ligation) را به بازار معرفی کرد و در همین سال نیز توسط شرکت ABI ) Applied biosystems) خریداری شد. با استفاده از این تکنولوژی، توالی هایی به طول ۷۵-۳۵ جفت باز خوانده می شود. مراحل آماده سازی نمونه ی DNA به طور تقریبی مشابه با سیستم توالی یابی ۴۵۴ است؛ به طوری که نمونه ی DNA مورد نظر به قطعات کوچکتری (حدود ۲۰۰ جفت باز) شکسته می شود و پس از اتصال آداپتور به انتهای قطعات حاصل، این قطعات از طریق Emulsion PCR تکثیر می گردند. 

در مرحلهی تعیین توالی، پرایمر توالی یابی که مکمل توالی آداپتور در انتهای قطعات DNA است، به این قطعات متصل می شود، سپس یک سری اکتامرهای اولیگو نوکلئوتیدی نشان دار شده با رنگهای فلورسنت، برای اتصال به پرایمر با یکدیگر رقابت می کنند. در این اکتامر، دو باز وسط (بازهای ۴ و ۵) با یکی از چهار رنگ فلورسنت نشان دار شده است. به این ترتیب، پس از اتصال اکتامر به پرایمر این بازها شناسایی خواهند شد.


مقالات مرتبط

توالی یابی نسل جدید

تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنولوژی 454 | پایروسکوئنسینگ

NGS | توالی یابی نسل جدید | next generation sequencing


 

تکنولوژی توالی یابی | Sequencing by oligonucleotide Ligation and detection | سیستم توالی یابی ۴۵۴ | Sequencing by ligation | آداپتور | Emulsion PCR | تعیین توالی | اکتامر | فلورسنت Sequencing error | توالی یابی چیست | تکنیک توالی یابی | sequencing | تکنیک‌های توالی یابی ژنوم | تکینک توالی یابی Sanger | توالی یابی DNA | تکنیک‌های توالی یابی نسل جدید | Next generation sequencing | توالی یابی نسل جدید | توالی یابی ۴۵۴ | توالی یابی Illumina | توالی یابی نسل سوم | تعیین توالی چیست | توالی یابی پایرو | روش های توالی یابی ژنوم | توالی یابی پروتئین | نسل جدید توالی یابی dna | توالی یابی rna | روش توالی یابی سنگر | تکنیک توالی یابی Sanger | تکنیک توالی یابی نسل جدید | تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنیک توالی یابی Illumina | تکنیک توالی یابی نسل سوم | مبانی بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک چیست . رشته بیو انفورماتیک . بیوانفورماتیک pdf . بیوانفورماتیک در ایران . رشته بیوانفورماتیک در ایران . بیوانفورماتیک به زبان ساده . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . کاربرد بیوانفورماتیک در بیوتکنولوژی ٬ مبانی بیوانفورماتیک . طراحی دارو چیست . کارگاه طراحی دارو ٬ . آموزش طراحی دارو ٬ طراحی واکسن ٬ نرم افزار های طراحی دارو ٬ طراحی دارو با کامپیوتر ٬ کتاب طراحی دارو ٬ بیوانفورماتیک pdf ٬ دانلود کتاب بیوانفورماتیک به زبان ساده فارسی . دانلود کتاب بیوانفورماتیک . دانلود رایگان کتاب بیوانفورماتیک به زبان فارسی . آموزش بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک دانشگاه تهران . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . سعید کارگر

اکتامر اولیگو نوکلئوتیدی پس از باز پنجم شکسته می شود و رنگ فلورسنت نیز آزاد می گردد. سپس، با اتصال اکتامر دیگر چرخه های هیبریداسیون و اتصال تکرار می شوند تا بازهای ۹ و ۱۰ تعیین توالی شوند. در چرخه بعدی بازهایی که در موقعیت های ۱۴ و ۱۵ قرار گرفته اند، توالی یابی می گردند. پس از یک سری چرخه های اتصال (Ligation)، قطعه ی مورد نظر با پرایمر مخصوص دیگری که مکمل موقعیت 1-n است، هیبرید می شود و دوباره، چرخه های اتصال اکتامر اولیگونوکلئوتیدی به پرایمر تکرار می گردد تا بازهای دیگر توالی یابی گردند. پس از ۵ دور هیبریداسیون پرایمرهای توالی یابی مختلف با قطعه ی مورد نظر و تکمیل تکرار چرخه های اتصال برای هر اکتامر اولیگو نوکلئوتیدی نشان دار، هر باز با استفاده از دو پرایمر توالی یابی و در طی دو واکنش اتصال مستقل توالی یابی می شود. این روش تعیین توالی در اصطلاح Two base encoding نامیده می شود (شکل).

صحت توالی های خوانده شده با استفاده از این تکنولوژی، در مقایسه با سیستم های دیگر در سطح بالایی است. به کمک این روش تعیین توالی، می توان بین خطای توالی یابی (Sequencing error) و چند شکلی تک نوکلئوتیدی (Single nucleotide polymorphism) تمایز قائل شد. این تمایز با در نظر گرفتن این مساله است که خطای توالی یابی تنها در یک واکنش تعیین توالی قابل ردیابی است، اما چند شکلی در هر دو واکنش شناسایی می شود. از این رو، دقت توالی یابی در این سیستم در مقایسه با سیستم های دیگر در سطح بالایی است. در ابتدا، در هر اجرای دستگاه تا Gb 3 توالی خوانده می شد، اما در دسامبر ۲۰۰۹، نسخه ی جدیدی از این تکنولوژی تحت عنوان Plus Plus 3TMsOLD معرفی شد که قادر است در هر اجرا، بیش از Gb ۶۰ توالی را بخواند.

توالی یابی چیست | تکنیک توالی یابی | sequencing | تکنیک‌های توالی یابی ژنوم | تکینک توالی یابی Sanger | توالی یابی DNA | تکنیک‌های توالی یابی نسل جدید | Next generation sequencing | توالی یابی نسل جدید | توالی یابی ۴۵۴ | توالی یابی Illumina | توالی یابی نسل سوم | تعیین توالی چیست | توالی یابی پایرو | روش های توالی یابی ژنوم | توالی یابی پروتئین | نسل جدید توالی یابی dna | توالی یابی rna | روش توالی یابی سنگر | تکنیک توالی یابی Sanger | تکنیک توالی یابی نسل جدید | تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنیک توالی یابی Illumina | تکنیک توالی یابی نسل سوم | مبانی بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک چیست . رشته بیو انفورماتیک . بیوانفورماتیک pdf . بیوانفورماتیک در ایران . رشته بیوانفورماتیک در ایران . بیوانفورماتیک به زبان ساده . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . کاربرد بیوانفورماتیک در بیوتکنولوژی ٬ مبانی بیوانفورماتیک . طراحی دارو چیست . کارگاه طراحی دارو ٬ . آموزش طراحی دارو ٬ طراحی واکسن ٬ نرم افزار های طراحی دارو ٬ طراحی دارو با کامپیوتر ٬ کتاب طراحی دارو ٬ بیوانفورماتیک pdf ٬ دانلود کتاب بیوانفورماتیک به زبان ساده فارسی . دانلود کتاب بیوانفورماتیک . دانلود رایگان کتاب بیوانفورماتیک به زبان فارسی . آموزش بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک دانشگاه تهران . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . سعید کارگر

تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنولوژی 454 | پایروسکوئنسینگ


آماده‌سازی نمونه برای واکنش Massively parallel pyrosequencing؛ A) DNA ژنومی استخراج، به قطعات کوچکتری تقسیم، به adaptorهای الیگونوکلئوتیدی متصل و سپس به مولکول‌های تک‌رشته‌ای تبدیل می‌شود. B) قطعات به bead ها متصل می‌شوند، طوری که در هر bead یک قطعه وجود داشته باشد. سپس bead ها در قطرات microreactor به دام می افتند. واکنش تکثیر PCR درون هر قطره اتفاق می‌افتد و در نتیجه آن هر bead حاوی حدود ۱۰ میلیون نسخه از یک توالی الگوی واحد می‌گردد. پس از شکافتن امولسیون، bead ها آزاد و مولکول‌های DNA دناتوره می‌شوند. هر bead که حاوی کلونی DNAهای تک‌رشته‌ای است، درون چاه‌های یک fiber-optic slide که حاوی ۱.۶ میلیون چاه است، رسوب داده می‌شود. سپس این چاه‌ها با لایه‌ای از beadهای کوچکتری که آنزیم‌های موردنیاز برای pyrosequencing روی آن‌ها ثابت شده است، پوشانده می‌شوند. | توالی یابی چیست | تکنیک توالی یابی | sequencing | تکنیک‌های توالی یابی ژنوم | تکینک توالی یابی Sanger | توالی یابی DNA | تکنیک‌های توالی یابی نسل جدید | Next generation sequencing | توالی یابی نسل جدید | توالی یابی ۴۵۴ | توالی یابی Illumina | توالی یابی نسل سوم | تعیین توالی چیست | توالی یابی پایرو | روش های توالی یابی ژنوم | توالی یابی پروتئین | نسل جدید توالی یابی dna | توالی یابی rna | روش توالی یابی سنگر | تکنیک توالی یابی Sanger | تکنیک توالی یابی نسل جدید | تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنیک توالی یابی Illumina | تکنیک توالی یابی نسل سوم | مبانی بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک چیست . رشته بیو انفورماتیک . بیوانفورماتیک pdf . بیوانفورماتیک در ایران . رشته بیوانفورماتیک در ایران . بیوانفورماتیک به زبان ساده . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . کاربرد بیوانفورماتیک در بیوتکنولوژی ٬ مبانی بیوانفورماتیک . طراحی دارو چیست . کارگاه طراحی دارو ٬ . آموزش طراحی دارو ٬ طراحی واکسن ٬ نرم افزار های طراحی دارو ٬ طراحی دارو با کامپیوتر ٬ کتاب طراحی دارو ٬ بیوانفورماتیک pdf ٬ دانلود کتاب بیوانفورماتیک به زبان ساده فارسی . دانلود کتاب بیوانفورماتیک . دانلود رایگان کتاب بیوانفورماتیک به زبان فارسی . آموزش بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک دانشگاه تهران . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . سعید کارگر

تکنولوژی Roche/454 Life Science

شرکت Roche/454 Life Science اولین موسسه پیشگام در تولید و تجاری سازی تکنولوژی NGS می باشد. این شرکت، در اواخر دهه ۱۹۹۰ برای اولین بار از تکنولوژی موسوم به  پایروسکوئنسینگ (Pyrosequencing) برای تعیین توالی DNA در مقیاس وسیع استفاده کرد. در این سیستم، نمونه ی DNA به قطعاتی با طول حدود ۱۰۰ جفت باز شکسته می شود. سپس، دو آداپتور کوتاه به انتهای قطعات متصل می شود. این آداپتورها، محل اتصال پرایمرهای لازم برای تکثیر و توالی یابی هستند.

این قطعات، با ذرات کوچکی که پوششی از جنس استرپتاویدین در سطح خود دارند، مخلوط می شوند و به کمک آداپتور B خود که در انتهای ۵ بیوتینه است، به این ذرات متصل می گردند. آن گاه، قطعات دو رشته ای متصل به ذرات، دناتوره و تک رشته ای می گردند. این مخلوط، به اندازه ی کافی رقیق است؛ به طوری که به هر ذره ی منفرد، تنها یک رشته ی DNA متصل می باشد. سپس، با افزودن ترکیبات لازم برای تکثیر قطعات DNA متصل به ذرات، این مخلوط به امولسیون تبدیل می شود. به این ترتیب، هر ذره با رشته ی DNA متصل به آن، در یک قطره ی امولسیون به دام می افتد و واکنش Polymerase chain reaction (PCR) به طور مستقل در هر قطره انجام می گردد (Emulsion PCR).

در مرحله ی بعد، به منظور تعیین توالی، ذرات حاوی DNA بر روی صفحه ی سلیکونی متشکل از ۴۰۰۰۰۰۰ چاهک منظم با حجمی در حد پیکولیتر پخش می شوند (۱۱). اندازه ی کوچک چاهک، باعث می شود تا در هر چاهک بیش از یک ذره قرار نگیرد (شکل 1). سپس آنزیم های لازم یعنی DNA پلیمراز، سولفوریلاز و لوسیفراز به چاهک افزوده می شوند. چاهک ها به طور مجزا پی در پی در معرض dGIP ، dTTP ،dCTP، ATP قرار می گیرند و بین هر بار افزودن سوبسترای دئوکسی نوکلئوتید، یک مرحله ی شستشو انجام می شود. بدیهی است که ورود هر نوکلئوتید به رشته ی در حال گسترش، وابسته به حضور باز مکمل در الگو می باشد. با ورود هر نوکلئوتید مکمل، یک مولکول پیرو فسفات رها می شود. آنزیم سولفوریلاز، این مولکول پیرو فسفات را با استفاده از آدنوزین فسفوسولفات (Adenosine phosphosulfate یا APS) به ATP تبدیل می کند. آنزیم لوسيفراز نیز به کمک ATP حاصل شده، سوبسترای خود را که لوسیفیرین می باشد به اکسی لوسیفرین تبدیل می کند. نور ساطع شده توسط دوربین های متصل به صفحه سیلیکونی ثبت و به صورت پیک در یک گراف نمایان می شود (شکل 1).


توالی یابی چیست | تکنیک توالی یابی | sequencing | تکنیک‌های توالی یابی ژنوم | تکینک توالی یابی Sanger | توالی یابی DNA | تکنیک‌های توالی یابی نسل جدید | Next generation sequencing | توالی یابی نسل جدید | توالی یابی ۴۵۴ | توالی یابی Illumina | توالی یابی نسل سوم | تعیین توالی چیست | توالی یابی پایرو | روش های توالی یابی ژنوم | توالی یابی پروتئین | نسل جدید توالی یابی dna | توالی یابی rna | روش توالی یابی سنگر | تکنیک توالی یابی Sanger | تکنیک توالی یابی نسل جدید | تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنیک توالی یابی Illumina | تکنیک توالی یابی نسل سوم | مبانی بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک چیست . رشته بیو انفورماتیک . بیوانفورماتیک pdf . بیوانفورماتیک در ایران . رشته بیوانفورماتیک در ایران . بیوانفورماتیک به زبان ساده . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . کاربرد بیوانفورماتیک در بیوتکنولوژی ٬ مبانی بیوانفورماتیک . طراحی دارو چیست . کارگاه طراحی دارو ٬ . آموزش طراحی دارو ٬ طراحی واکسن ٬ نرم افزار های طراحی دارو ٬ طراحی دارو با کامپیوتر ٬ کتاب طراحی دارو ٬ بیوانفورماتیک pdf ٬ دانلود کتاب بیوانفورماتیک به زبان ساده فارسی . دانلود کتاب بیوانفورماتیک . دانلود رایگان کتاب بیوانفورماتیک به زبان فارسی . آموزش بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک دانشگاه تهران . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . سعید کارگر

رونقی و همکاران، در سال ۱۹۹۸ از پایه گذاران پایروسکوئنسینگ بودند (۱۲). در آخرین نسخه ی ارایه شده از طرف شرکت Roch، این تکنولوژی می تواند تا ۱۴ گیگاباز (Giga bases ; Gb ) توالی با طول متوسط ۷۰۰ جفت باز تولید کند. طول بلند توالی‌های تولید شده توسط این روش و سرعت بالا، از مهم ترین ویژگی‌های این تکنولوژی می‌باشد. هر اجرای پایروسکوئنسینگ بسیار سریع است؛ در واقع، این تکنیک می تواند تعداد زیادی اجرا را به طور همزمان انجام دهد. به عنوان مثال، ۹۶ اجرای مختلف می تواند به طور همزمان در یک پلیت ۹۶ چاهکی انجام شود، از آن جایی که کل فرایند اتوماتیک است، نیاز چندانی به توجه فرد آزمایش کننده ندارد. بدیهی است هر تکنولوژی در کنار مزایای خود، یک سری معایب نیز دارد و یکی از معایب این روش، درصد خطای به نسبت بالای آن در نواحی هموپلیمر DNA است. هزینه ی بالای توالی یابی با این روش در مقایسه با سایر روش های توالی یابی در مقیاس وسیع، عیب دیگر این تکنولوژی به شمار می رود که استفاده از آن را تا حدی محدود می کند (۱۳).

تکنولوژی ۴۵۴، توالی های بلندتری را در مقایسه با روش های دیگر توالی یابی در مقیاس وسیع تولید می کند. این مسأله، دقت و سر هم نمودن این توالی ها را به توالی های بلندتر را به طور قابل توجهی افزایش می دهد. با این وجود، چون تعداد خوانش های تولید شده در

هر اجرای این دستگاه اندک است، استفاده از آن برای موجوداتی با اطلاعات ژنتیک محدود، مستلزم اجرای متعدد می باشد که از نظر اقتصادی چندان مقرون به صرفه نیست. در مقابل، این تکنیک ابزاری قدرتمند برای توالی یابی مجدد ژنوم های شناخته شده می باشد (۱۱). به عنوان مثال، این روش برای توالی یابی بخش هایی از ژنهای یک شخص، به منظور تشخیص جهش های بیماری زا به خوبی عمل می کند. به منظور افزایش سرعت در این مورد، نوکلئوتیدها می توانند به همان ترتیبی که در توالی طبیعی شناخته شده وجود دارند، اضافه شوند. به این ترتیب، جهش از طریق عدم توانایی نوکلئوتید طبیعی برای اتصال در یک موقعیت خاص به سادگی تشخیص داده می شود (۱۰).

تکنیک توالی یابی ۴۵۴

قسمت دوم

Massively parallel pyrosequencing در سال ۲۰۰۵ توسط شرکت ۴۵۴ Life Sciences توسعه یافت و توسط Roche تجاری‌سازی شد. این تکنیک، توالی یابی ۴۵۴ نام دارد و نخستین تکنیک از توالی یابی‌های نسل جدید است. توالی یابی ۴۵۴ می‌تواند بیش از یک میلیارد باز DNA را در یک روز تعیین توالی کند (معادل یک سوم ژنوم انسان). اولین گام در این تکنولوژي، آماده‌سازی DNA به منظور تکثیر توسط PCR است. در واقع این تکنیک‌ها به جای این که از محصولات PCR یا توالی‌های کلون‌شده استفاده کنند، کار خود را با DNA ژنومی آغاز می‌نمایند. DNA ژنومی طبق پروتکل استاندارد استخراج DNA، از ارگانیسم موردنظر استخراج و سپس DNA خالص با استفاده از هموژنایزر اولتراسونیک (طی فرایند sonication) (و یا با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده)، به قطعات کوچکتری با اندازه ۳۰۰ تا ۵۰۰ جفت‌باز تقسیم می‌شود.


مقالات مرتبط:

NGS | توالی یابی نسل جدید | next generation sequencing

تکنولوژی ABI / SOLD


به منظور تکثیر هر کدام از قطعات، انتهایشان باید دارای توالی شناخته‌شده‌ای باشد و این موضوع خصوصا در ژنوم‌هایی که هرگز توالی یابی نشده‌اند، غیرممکن است. حتی اگر توالی شناخته شده باشد نیز سونیکاسیون به صورت تصادفی DNA را می‌شکند و راهی برای شناخت دقیق توالی هر کدام از انتهاها وجود ندارد. راه حلی که برای دور زدن این مشکل به کار گرفته می‌شود، استفاده از linker ها یا آداپتورها است که قطعات DNA کوتاهی با توالی شناخته شده می‌باشند. اتصال دو آداپتورمتفاوت به انتهاهای قطعات DNA صورت می‌گیرد و پس از دناتوراسیون، مولکول‌های تک‌رشته‌ای دارای آداپتورهای متفاوت در دو انتها، گزینش می‌شوند. آداپتورها دو وظیفه بر عهده دارند: نخست اینکه باعث اتصال قطعات به bead ها می‌شوند و دوم اینکه به عنوان مکانی برای اتصال پرایمر عمل می‌کنند. درنتیجه پرایمر یکسانی برای تمام قطعات می‌تواند استفاده شود.

مرحله بعدی، اتصال مولکول‌های انتخاب شده به bead ها است و با استفاده از مکانیسم استرپتاویدین-بیوتین انجام می‌پذیرد. پروتئین باکتریایی استرپتاویدین تمایل اتصال بالایی به ویتامین بیوتین دارد و با طراحی یکی از دو آداپتور به نحوی که در انتهای ۵’ خود دارای تگ بیوتین باشد، مولکول‌های DNA به bead های پوشیده شده با استرپتاویدین متصل خواهند شد. به این نحو مولکول‌های الگوی تک‌رشته‌ای DNA روی beadها ثابت می‌شوند و بعدا قطعات تولیدشده طی PCR نیز به سطح آن متصل خواهند شد.

جداسازی bead ها از یکدیگر با تشکیل امولسیون روغن در آب انجام می‌گیرد، طوری که هر قطره حاوی یک bead و واکنش‌دهنده‌های لازم برای PCR (دئوکسی نوکلئوتیدهای آزاد، پرایمرهای مکمل آداپتور و Taq پلیمراز) باشد. این موضوع در این تکنیک بسیار حیاتی است. این قطره‌ها microreactor نام دارند. وجود امولسیون، مانع از پراکنده شدن مولکول‌های DNA و واکنش‌دهنده‌ها از یک bead به سایر beadها می‌گردد.

پس از اتمام PCR، حدود ده میلیون نسخه از هر قطعه DNA به صورت ثابت‌شده بر روی هر bead وجود خواهد داشت. در مرحله بعدی امولسیون از هم پاشیده می‌شود و beadها در چاه‌های picoliter که روی یک اسلاید قرار دارند، رسوب داده می‌شوند، به نحوی که هر چاه حاوی یک bead باشد. سطح تحتانی چاه‌ها شفاف است و نور تولید شده می‌تواند از آن عبور کرده و توسط دستگاه شناسایی شود.

چاه‌ها سپس با bead های کوتاه‌تری که سطحشان دارای ATP سولفوریلاز و لوسیفراز است، پوشانده می‌شوند. پیش‌سازهای dNTP یک‌به‌یک و با ترتیب مشخصی (T، سپس A، سپس C، سپس G) به bead ها افزوده می‌شوند و همزمان با تکثیر، خوانش توالی‌ها صورت می‌گیرد (sequencing by synthesis)؛ به این نحو که با هر بار اتصال نوکلئوتید درست، نور نشرشده در تمام واکنش‌ها شناسایی و ضبط می‌گردد. شدت نور تولیدشده منطبق بر تعداد نوکلئوتیدهایی از یک نوع است که به رشته الگو متصل شده‌اند. به عنوان مثال شدت نوری که در اثر اتصال سه باز A ایجاد می‌شود، سه برابر حالتی است که یک باز A وجود دارد.

تکنیک Massively parallel sequencing شرکت ۴۵۴ Life Sciences، در هر واکنش توالی‌ یابی، توالی‌های نسبتا بلندی را می‌خواند و به علاوه هزاران عدد از چنین واکنش‌هایی را به طور موازی انجام می‌دهد. در نتیجه محصول نهایی حدود ۱۰هزار بار بزرگتر از توالی یابی دی دئوکسی می‌گردد. البته ایراداتی نیز در این تکنیک وجود دارد؛ از جمله اینکه تشخیص تعداد بازها در حالتی که چندین باز تکراری به دنبال هم می‌آیند (مثلا AAAAAA) دشوار است.

توالی یابی چیست | تکنیک توالی یابی | sequencing | تکنیک‌های توالی یابی ژنوم | تکینک توالی یابی Sanger | توالی یابی DNA | تکنیک‌های توالی یابی نسل جدید | Next generation sequencing | توالی یابی نسل جدید | توالی یابی ۴۵۴ | توالی یابی Illumina | توالی یابی نسل سوم | تعیین توالی چیست | توالی یابی پایرو | روش های توالی یابی ژنوم | توالی یابی پروتئین | نسل جدید توالی یابی dna | توالی یابی rna | روش توالی یابی سنگر | تکنیک توالی یابی Sanger | تکنیک توالی یابی نسل جدید | تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنیک توالی یابی Illumina | تکنیک توالی یابی نسل سوم | مبانی بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک چیست . رشته بیو انفورماتیک . بیوانفورماتیک pdf . بیوانفورماتیک در ایران . رشته بیوانفورماتیک در ایران . بیوانفورماتیک به زبان ساده . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . کاربرد بیوانفورماتیک در بیوتکنولوژی ٬ مبانی بیوانفورماتیک . طراحی دارو چیست . کارگاه طراحی دارو ٬ . آموزش طراحی دارو ٬ طراحی واکسن ٬ نرم افزار های طراحی دارو ٬ طراحی دارو با کامپیوتر ٬ کتاب طراحی دارو ٬ بیوانفورماتیک pdf ٬ دانلود کتاب بیوانفورماتیک به زبان ساده فارسی . دانلود کتاب بیوانفورماتیک . دانلود رایگان کتاب بیوانفورماتیک به زبان فارسی . آموزش بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک دانشگاه تهران . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . سعید کارگر

NGS | توالی یابی نسل جدید | next generation sequencing

توالی یابی نسل جدید (NGS)

معرفی توالی یابی نسل جدید (Next Generation Sequencing= NGS) در سال ۲۰۰۷ تحولی در دنیای ژنومیکس پدید آورد، روشی کاملا جدید برای تعیین توالی DNA معرفی نمود و هزینه و زمان موردنیاز برای توالی یابی ژنوم را به شدت کاهش داد. مثالی که برای اهمیت این روش می‌توان عنوان کرد آن است که پروژه ژنوم انسان ۱۰ سال طول کشید و بیش از ۳ میلیارد دلار بودجه مصرف کرد؛ این در حالی است که امروزه توالی یابی نسل جدید می‌تواند در عرض یک روز کل ژنوم انسان را با صرف هزینه‌ای در حدود ۵۰۰۰ دلار توالی یابی کند. یکی از علل این موضوع آماده‌سازی سریع‌تر نمونه نسبت به تکنیک‌های پیشین است؛ به عنوان مثال دیگر نیازی به تولید کتابخانه‌های DNA در باکتری‌ها نیست.علاوه بر صرفه‌جویی در هزینه و زمان، پس از کشف این تکنیک‌ها تعداد ژنوم‌های توالی یابی شده نیز افزایش قابل توجهی داشته است. دو متد اصلی برای این نوع از توالی یابی وجود دارد: توالی یابی ۴۵۴ و Illumina.

next generation sequencing

این تکنیک‌ها نیازی به الکتروفورز ندارند و ثبت توالی DNA را همزمان با سنتز آن از DNA الگوی تک‌رشته‌ای انجام می‌دهند. به عبارت دیگر در این تکنیک‌ها، اتصال هر کدام از انواع نوکلئوتیدها به زنجیره DNA در حال رشد بررسی می‌شود. توالی یابی‌های نسل جدید از پلت‌فرم‌هایی استفاده می‌کنند که می‌توانند میلیون‌ها قطعه DNA را در موقعیت‌هایی جداگانه ثابت و سپس آنالیز کنند و درنتیجه چندین ژنوم می‌توانند به طور موازی در عرض کمتر از یک هفته توالی یابی شوند. همچنین این تکنیک‌ها بسیار انعطاف‌پذیر هستند و می‌توانند برای تمام انواع و اندازه‌های مختلف ژنوم، از ویروس گرفته تا انسان به کار روند.


مقالات مرتبط

توالی یابی نسل جدید

تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنولوژی 454 | پایروسکوئنسینگ

تکنولوژی ABI / SOLD


طبق موارد گفته شده، این تکنیک‌ها این امکان را برای پژوهشگران پدید می‌آورد که ژنوم هزاران انسان را بررسی کنند، تفاوت‌های موجود در توالی نوکلئوتیدی افراد در سراسر جهان را بیابند و پرده از جهش‌هایی که ریسک ابتلا به بیماری‌های مختلف از سرطان تا اوتیسم را افزایش می‌دهند، بردارند. تکنیک‌های توالی یابی نسل جدید همچنین امکان تعیین توالی ژنومی گونه‌های منقرض شده مانند نئاندرتال‌ها و ماموت‌ها را فراهم می‌کند. همچنین با توالی‌یابی گونه‌های نزدیک به هم، درک اساس مولکولی رخدادهای کلیدی تکاملی در درخت زندگی، مانند چندسلولی شدن، بینایی و زبان آسان‌تر شده است. افزایش سرعت توالی‌یابی تاثیراتی شگرف بر شاخه‌های مختلف بیولوژي و پزشکی گذاشته است؛ تا حدی که تصور وضعیت این علوم بدون آن‌ها ممکن نیست.

تصویر ۴ . ماشین‌های کاملا اتوماتیک می‌توانند واکنش‌های توالی یابی دی دئوکسی را انجام دهند. در این تکنیک‌ها dNTPهای نرمال در مقادیر بالا به همراه مخلوطی از چهار نوع ddNTP مورد استفاده قرار می‌گیرند. چهار رنگ فلورسنت جداگانه به عنوان لیبل در واکنش‌های اختصاصی باز استفاده می‌شوند. لیبل‌ها می‌توانند به ddNTP اختصاصی باز اتصال یابند و یا اینکه به پرایمر متصل شوند و چهار نوع پرایمر متفاوت که چهار واکنش را از هم تمایز می‌دهند را داشته باشیم. نمونه‌های حاوی هر چهار واکنش توالی یابی توسط الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید بر اساس اندازه از همدیگر جدا می‌شوند. در این تصویر قطعات در ژل slab و در حال مهاجرت به سمت پایین نشان داده شده‌اند. همزمان با مهاجرت قطعات به سمت پایین در حین الکتروفورز، پرتو لیزر بر روی نقطه ثابتی در ژل تابیده می‌شود و این کار باعث نشر رنگ فلورسنت از قطعات DNA در حال عبور از این نقطه می‌گردد. بیشترین فلورسنت هر کدام از رنگ‌ها در طول موج‌های مختلفی رخ می‌دهد. اطلاعات به صورت الکترونیک ضبط و توالی در یک دیتابیس کامپیوتری ذخیره می‌گردد. هر قله رنگی نشانگر یک نوکلئوتید در توالی DNA است | توالی یابی چیست | تکنیک توالی یابی | sequencing | تکنیک‌های توالی یابی ژنوم | تکینک توالی یابی Sanger | توالی یابی DNA | تکنیک‌های توالی یابی نسل جدید | Next generation sequencing | توالی یابی نسل جدید | توالی یابی ۴۵۴ | توالی یابی Illumina | توالی یابی نسل سوم | تعیین توالی چیست | توالی یابی پایرو | روش های توالی یابی ژنوم | توالی یابی پروتئین | نسل جدید توالی یابی dna | توالی یابی rna | روش توالی یابی سنگر | تکنیک توالی یابی Sanger | تکنیک توالی یابی نسل جدید | تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنیک توالی یابی Illumina | تکنیک توالی یابی نسل سوم | مبانی بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک چیست . رشته بیو انفورماتیک . بیوانفورماتیک pdf . بیوانفورماتیک در ایران . رشته بیوانفورماتیک در ایران . بیوانفورماتیک به زبان ساده . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . کاربرد بیوانفورماتیک در بیوتکنولوژی ٬ مبانی بیوانفورماتیک . طراحی دارو چیست . کارگاه طراحی دارو ٬ . آموزش طراحی دارو ٬ طراحی واکسن ٬ نرم افزار های طراحی دارو ٬ طراحی دارو با کامپیوتر ٬ کتاب طراحی دارو ٬ بیوانفورماتیک pdf ٬ دانلود کتاب بیوانفورماتیک به زبان ساده فارسی . دانلود کتاب بیوانفورماتیک . دانلود رایگان کتاب بیوانفورماتیک به زبان فارسی . آموزش بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک دانشگاه تهران . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . سعید کارگر

تکنیک‌های توالی یابی | sequencing | توالی یابی نسل جدید

تکنیک‌های توالی یابی | sequencing | توالی یابی نسل جدید

بسیاری از متدهای امروزی دستکاری DNA، RNA و پروتئین‌ها، وابسته به وجود دانش قبلی راجع به توالی نوکلئوتیدی ژنوم موردنظر هستند. اما خود این توالی‌ها برای نخستین بار چگونه شناخته شده‌اند؟ و امروزه توالی مولکول‌های DNA و RNA چگونه تعیین می‌گردد؟ تکنیک توالی یابی (sequencing) فرایند تعیین ترتیب دقیق بازها در نوکلئیک‌اسیدها است و باعث جهش ناگهانی در دانش ما از ژنتیک شده است. روش‌های انجام هر چه سریع‌تر و آسان‌تر این فرایند عامل پیش‌برنده پیشرفت‌های اخیر بیوتکنولوژی است.

ایجاد کتابخانه‌های DNA پایه تکنیک‌های توالی یابی ژنوم بود و انجام آن را امکان پذیر ساخت. در اواخر دهه ۱۹۷۰ بود که محققان تکنیک‌هایی را برای تعیین سریع و آسان توالی‌های نوکلئوتیدی قطعات DNA خالص معرفی کردند. متدی که تاکنون بیشتر از همه مورد استفاده قرار گرفته است، تکینک توالی یابی سنگر نام دارد و اساس آن آنزیمی می‌باشد. طی این متد DNA پلیمراز با استفاده از توالی‌های الگوی کلون شده و تک‌رشته‌ای، رشته جدید را سنتز می‌کند. توالی یابی Sanger زیربنای تمام تکنولوژي‌های توالی یابی است که امروزه مورد استفاده قرار می‌گیرند و ژنومیکس (علم مطالعه ژنوم‌) را شکل داده است.

تکنیک سنگر ( Sanger )

تکنیک Sanger به منظور تعیین توالی ژنوم‌های فراوانی مانند E. coli، مگس سرکه، کرم‌های نواری (نماتودها)، موش و انسان مورد استفاده قرار گرفته است. Sanger و همکارانش نخستین دانشمندانی بودند که کل ژنوم یک جاندار را با استفاده از این تکنیک توالی یابی کردند. این ژنوم طولی در حدود ۵۰۰۰ باز داشت و متعلق به ویروسی به نام phiX174 بود. پس از این دستاورد آنان به تعیین توالی ژنوم‌های دیگری مانند ژنوم میتوکندری انسان ادامه دادند.

توالی یابی DNA با استفاده از تکنیک Sanger در توالی یابی ابتدایی ژنوم انسان بسیار کمک کننده بود. با این حال متدهای ابتدایی آهسته بودند، نیاز به نیروی انسانی‌ فراوانی داشتند، هزینه تهیه مواد اولیه بالا بود، پیشرفت واکنش‌ها نیاز به شرایط پیچیده‌ای داشت و بازده واکنش‌ها نیز پایین بود. در نتیجه سال‌ها طول می‌کشید که یک یا دو ژن توالی یابی شوند.

توالی یابی ژنوم انسان

توالی مرجع ژنوم انسانی برای نخستین بار در سال ۲۰۰۳، با صرف یک میلیارد دلار هزینه و در طول ۱۳ سال تکمیل شد. در طول این پروژه هزینه تعیین توالی هر باز به علت وقوع پیشرفت در متد خاتمه زنجیر به همراه الکتروفورز موئین کاهش پیدا کرد و باعث شد که به بودجه‌ای کمتر از حد انتظار نیاز داشته باشد. هزینه توالی یابی برای یک میلیون باز DNA در سپتامبر ۲۰۰۱، ۵۲۹۲ دلار و برای کل ژنوم انسان ۹۵ میلیون دلار بود.

در طی دهه اخیر، تکنولوژی‌های توالی یابی پیشرفت فراوانی کرده‌اند؛ به نحوی که می‌توان در عرض چند ساعت و با صرف هزینه‌ کمتر، کل ژنوم انسان را که دارای طولی در حدود ۳.۲ بیلیون باز است، توالی یابی کرد. به طوری که تا اکتبر ۲۰۱۳ هزینه توالی یابی یک میلیون جفت باز به کمتر از ۶ سنت و درنتیجه هزینه توالی یابی کل ژنوم به حدود ۵۰۹۶ دلار رسید.

علت وقوع این کاهش چشمگیر، تکنیک‌های توالی یابی نسل جدید (Next generation sequencing) بودند. معرفی توالی یابی نسل جدید در سال ۲۰۰۷ هیجانی در علم ژنومیکس پدید آورد و روشی کاملا جدید برای توالی یابی معرفی نمود. علاوه بر کاهش زمان و هزینه موردنیاز، تعداد ژنوم‌های تعیین توالی شده نیز با ابداع این تکنیک‌ها افزایش قابل توجهی پیدا کرد. از جمله این متد‌ها می‌توان به تکنیک توالی یابی ۴۵۴ و Illumina اشاره کرد.

امروزه حتی متدهای جدیدتر، دقیق‌تر، ارزان‌تر و سریع‌تری نیز در حال توسعه هستند و تکنولوژی‌های نسل سوم خوانده می‌شوند. این تکنیک‌ها فاقد تمام مراحل تکثیر DNA هستند و توالی یک مولکول واحد DNA را تعیین می‌کنند. یکی از جدیدترین تکنیک‌های توالی یابی نسل سوم، SMRT نام دارد و از جمله ویژگی‌های خارق‌العاده آن، کاهش نیاز به مواد اولیه گران قیمت، حساسیت بالا و پدید آوردن امکان مشاهده DNA پلیمراز هنگام ساخت رشته جدید است. استفاده از این تکنیک برای توالی یابی ژنوم انسان هنوز امکان‌پذیر نیست، اما اگر ممکن شود، خواهیم توانست به کمک آن کل ژنوم را در حدود یک ساعت توالی یابی کنیم. به احتمال زیاد در آینده شاهد توسعه متدهایی که حتی سریع‌تر و ارزان‌تر از متدهای کنونی هستند نیز خواهیم بود.

تکنیک توالی یابی سنگر ( Sanger )

در سال ۱۹۷۴ Fredrick Sanger تکنیکی را به منظور تعیین توالی ژن‌ها در محیط in vitro ابداع کرد. او به توالی آمینواسیدی انسولین علاقه‌مند بود و تصمیم گرفت که با استفاده از توالی نوکلئوتیدی آن به توالی آمینواسیدی‌اش برسد. متدی که Sanger و همکارانش در Medical Research Council Laboratory کمبریج اختراع کردند، روش خاتمه زنجیره سازی (Chain termination) نام گرفت و امروزه نیز کاربرد دارد. از جمله علل محبوبیت این تکنیک اتوماسیون آسان آن است.

توالی یابی سنگر ( Sanger )

توالی یابی Sanger همانند فرایند تکثیر DNA نیاز به پرایمر (رشته الیگونوکلئوتیدی کوتاهی از جنس RNA) که باید به نقطه یکسانی در تمام مولکول‌ها متصل ‌گردد)، DNA پلیمراز، توالی الگوی تک‌رشته‌ای و دئوکسی نوکلئوتیدها دارد. در طی واکنش، این مواد در محیط in vitro با یکدیگر مخلوط می‌شوند و پلیمراز نسخه‌های فراوانی را از توالی اصلی تولید می‌کند. اساس این تکنیک فرایند طبیعی همانندسازی DNA است و واکنش در حالت عادی می‌تواند تا پلیمریزه شدن هزاران نوکلئوتید ادامه پیدا کند؛ با این تفاوت که در این مورد همانندسازی در نقاطی قطع می شود و رشته‌هایی در اندازه‌های متفاوت به دست می‌آیند.

سوبسترای واکنش غالبا DNA نوترکیبی بود که در اثر دناتوراسیون توانایی اتصال به پرایمر توالی‌‌یابی اختصاصی رشته را پیدا می‌کرد. قطعات DNA در وکتورهای فاژمیدی که در اثر دستکاری می‌توانستند DNAهای نوترکیب تک‌رشته‌ای تولید کنند، نیز کلون می‌شدند. روش جایگزینی که امروزه نیز کاربرد فراوانی دارد، تولید قطعات DNA الگو با استفاده از PCR و تبدیل مولکول‌های حاصل به فرم تک رشته‌ای است. در این حالت پلیمراز مورد استفاده نباید دارای خاصیت proofreading باشد تا سرعت الحاق نوکلئوتیدها افزایش یابد. محصول نهایی در تمام موارد ذکرشده، نسخه‌های فراوانی از مولکول DNA تک‌رشته‌ای موردنظر است.

نخستین ترفند به دست آوردن توالی، متوقف کردن سنتز رشته جدید در هر کدام از جفت‌بازها است. این کار با مهار تصادفی سنتز زنجیره جدید DNA و درنتیجه تولید رشته‌هایی با طول‌های متفاوت که می‌توانند بر مبنای اندازه از یکدیگر جدا شوند، صورت می‌گیرد. در نتیجه تفاوت اندازه قطعات تولیدشده با یکدیگر در حدود یک جفت باز خواهد بود و در الکتروفورز نردبانی از قطعات به دست خواهد آمد. ترفند دوم تعیین ماهیت نوکلئوتید آخر هر قطعه است که اگر مشخص باشد، می‌توان توالی را به طور مستقیم از روی ژل خواند. اما سوال این است که چگونه می‌توان باز آخر هر قطعه را در نردبان توالی یابی تعیین کرد؟

DNA پلیمراز سنتز رشته جدید DNA را بر اساس توالی رشته الگو انجام می‌دهد. زنجیره DNA حاوی دئوکسی نوکلئوتیدهایی است که دارای گروه هیدروکسیل در موقعیت ۳’ حلقه دئوکسی ریبوز می‌باشند. DNA پلیمراز افزودن نوکلئوتید بعدی را با اتصال فسفات روی کربن ۵’ آن، به ۳’-هیدروکسیل نوکلئوتید پیشین و با تشکیل پیوند فسفودی‌استر انجام می‌دهد. در صورتیکه یکی از نوکلئوتیدها فاقد ۳’-هیدروکسیل باشد، نوکلئوتید دیگری افزوده نخواهد شد و زنجیره به طور ناگهانی خاتمه خواهد یافت.

در حین واکنش توالی یابی سنگر، درصد معینی از نوکلئوتیدها که فاقد ۳’-هیدروکسیل هستند و دی دئوکسی نوکلئوتید (dideoxynucleotide: ddNTP) نامیده می‌شوند، با دئوکسی نوکلئوتیدهای نرمال مخلوط می‌شوند. آنزیم‌های پلیمراز توانایی افتراق دئوکسی نوکلئوتیدها از دی دئوکسی نوکلئوتیدها را ندارند و این نوع از نوکلئوتیدها در صورت اتصال، به عنوان خاتمه دهنده زنجیره اختصاصی باز (base specific chain terminator) عمل خواهند کرد.

همان طور که گفته شد دئوکسی ریبونوکلئوتیدها در مقادیر بسیار بالاتری نسبت به دی دئوکسی ریبونوکلئوتیدها حضور دارند، در نتیجه خاتمه سنتز زنجیره جدید همواره در نزدیکی پرایمر رخ نمی‌دهد. در واقع ممکن است پلیمریزاسیون چند صد نوکلئوتید صورت بگیرد، پیش از آن که باز خاتمه دهنده رشته افزوده شود. در چنین واکنش‌هایی معمولا حداکثر طول قطعات ۸۰۰ نوکلئوتید خواهد بود.

تصویر ۱ . در دی دئوکسی ریبونوکلئوتیدها، گروه هیدروکسیلی که در نوکلئوتیدهای نرمال به کربن ۳’ متصل است، با اتم هیدروژن جایگزین می‌گردد.

تکنیک توالی یابی Sanger بر این پدیده استوار است که مولکول‌های DNA تک‌رشته‌ای که تفاوتشان با یکدیگر تنها در حد یک نوکلئوتید است، می‌توانند توسط الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید از یکدیگر جدا شوند. اساس این نوع از الکتروفورز با الکتروفورز در ژل آگارز یکسان است، با این تفاوت که حفرات در ژل پلی آکریل آمید کوچکتر هستند و در نتیجه امکان تفکیک قطعات کوچکتر را با دقت بالاتری پدید می‌آورند. در صورتی که این نوع از الکتروفورز از نوع Denaturing باشد، به علت وجود مقادیر بالای اوره و سایر ترکیبات دناتوره‌کننده مولکول‌های DNA به صورت تک‌رشته‌ای باقی خواهند ماند.

۲ . الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید مولکول‌های تک‌رشته‌ای DNA که تنها در یک نوکلئوتید با همدیگر تفاوت دارند را از همدیگر تفکیک کنند. مولکول‌های DNA با مارکر رادیواکتیو لیبل شده اند و مشاهده آن‌ها با اتورادیوگرافی صورت می‌گیرد. در اثر قرار گرفتن فیلم در معرض اشعه X، DNAهای لیبل شده به رنگ سیاه در می‌آیند.

نحوه خواندن توالی یابی سنگر

نحوه خواندن توالی از پایین به بالا است؛ چون قطعاتی که نزدیک پرایمر خاتمه یافته‌اندو سریعتر از مولکول‌هایی حرکت می‌کنند که در نقطه‌ای دور از پرایمر جدا شده اند. نوارهای الکتروفورز به صورت نردبانی مشاهده می‌شوند که پله‌های آن به اندازه یک نوکلئوتید از هم فاصله دارند. درنتیجه هر نوار نشان‌گر نوکلئوتیدی با توالی مکمل دی دئوکسی نوکلئوتیدی است که زنجیره را در آن نقطه خاتمه داده است. به عنوان مثال اگر دی دئوکسی نوکلئوتید A زنجیره را خاتمه داده باشد، نوکلئوتید موجود در رشته اصلی T است.

توالی یابی Sanger به صورت چهار واکنش موازی انجام می‌گیرد که هر کدام شامل ۴ نوع دئوکسی ریبونوکلئوتید (dATP، dCTP، dGTP، dTTP) به همراه درصد کمی از یکی از انواع دی دئوکسی نوکلئوتید می‌باشد. یکی از ۴ دئوکسی نوکلئوتید و یا پرایمر باید لیبل شده باشند تا رشته در حال سنتز نیزعلامت‌گذاری شود. با تنظیم غلظت دی دئوکسی نوکلئوتید در حدی بسیار پایین‌تر از آنالوگ دئوکسی نوکلئوتیدی آن، رقابتی بین این دو به منظور اتصال به رشته DNA در حال ساخت شکل خواهد گرفت. مقدار دئوکسی نوکلئوتید بسیار بیشتر است و با اتصال آن، سنتز DNA ادامه پیدا می‌کند، تا اینکه گاهی اوقات ناگهان با اتصال دی دئوکسی نوکلئوتید، پلیمریزاسیون متوقف و تولید زنجیره خاتمه می‌یابد.

از آن جایی که نمونه DNA شامل جمعیتی از مولکول‌های یکسان است، هر یک از این چهار واکنش اختصاصی باز انتهای ۵’ مشترکی خواهند داشت که توسط پرایمر تعیین می‌شود. انتهای ۳’ در بین این قطعات متفاوت است، چون اتصال ddNTPها به صورت تصادفی و در یکی از نقاط فراوانی که قابلیت پذیرش آن باز را دارند انجام می‌شود.

تصویر ۳ . به منظور تعیین توالی کامل این قطعه DNA تک‌رشته‌ای (خاکستری)، مولکول DNA ابتدا با یک پرایمر کوتاه (نارنجی) که با رنگ فلورسنت یا رادیوایزوتوپ لیبل شده است، هیبرید می‌شود. DNA پلیمراز و مقادیر فراوانی از هر ۴ نوع dNTP نرمال (آبی) به DNA متصل‌شده به پرایمر، افزوده می‌شوند و سپس مخلوط واکنش بین ۴ لوله جداگانه تقسیم می‌گردد. به هر کدام از این لوله‌ها مقادیر اندکی از یک نوع ddNTP اضافه می‌شود (قرمز). چون در هر لوله مقادیر فراوانی از یک نوع توالی الگو وجود دارد و نوکلئوتیدهای خاتمه دهنده زنجیره تنها گاها به زنجیره در حال ساخت وارد می‌گردند، هر واکنش مجموعه‌ای از نسخه‌ها را داراست که در نقاط مختلفی از توالی خود خاتمه یافته اند. محصولات این ۴ واکنش توسط الکتروفورز و به صورت ۴ ستون موازی ژل پلی آکریل آمید از یکدیگر جدا می‌شوند. در هر ستون نوارها نشان دهنده قطعاتی هستند که در نقاط متفاوتی در نوکلئوتید موردنظر خاتمه یافته اند. با شروع از انتهای ژل و خواندن یک به یک تمام نوارها، توالی رشته‌های سنتز شده DNA تعیین می‌گردد. توالی درج شده در فلش سبز مکمل توالی رشته اصلی (خاکستری) می‌باشد.

اتوماسیون تکنیک توالی یابی Sanger کارایی آن را افزایش می‌دهد

در سال‌های ابتدایی انجام این تکنیک، دانشمندان مجبور بودند خوانش توالی‌ها را  به صورت دستی و از روی اتورادیوگرام انجام دهند. هر کدام از انواع باز در ستونی جداگانه قرار داشت و خوانش اتورادیوگرام از پایین به بالا انجام می‌شد. داده‌ها نیز به صورت دستی وارد کامپیوتر می‌شدند. همان طور که می‌توانید تصور کنید، این پروسه بسیار طولانی بود. ۱۲ ساعت برای الکتروفورز، ۱۲ ساعت برای ایجاد اتورادیوگرام و مدت زمان بسیار طولانی‌تری برای خواندن توالی‌ها موردنیاز بود. علاوه بر آن احتمال وقوع اشتباه نیز بالا و استفاده از بازهای لیبل شده با مواد رادیواکتیو خطرناک بود.

با توجه به موارد گفته شده، انجام تعدادی از اصلاحات ضروری بودند، خصوصا اگر هدف توالی یابی ژنوم‌های بزرگتری مانند ژنوم انسان بود. ماشین‌های توالی یابی اتوماتیک که از رنگ‌های فلورسنت استفاده می‌کردند، در اوایل دهه ۱۹۹۰ به صورت تجاری موجود شدند. انجام فرایند توالی یابی به صورت ماشینی جلوگیری از وقوع اشتباهات را آسان‌تر می‌کرد و سریع‌تر و امن‌تر نیز بود. با اینکه به علت گران قیمت بودن دستگاه آنالیزکننده توالی، هزینه راه‌اندازی این تکنیک بسیار بالا است، اما از آن جایی که چندین نمونه به صورت همزمان آنالیز می‌شوند، هزینه توالی یابی هر کدام از نمونه‌ها بسیار پایین است.

در این فرایند، مخلوط واکنش شامل ۴ نوع دئوکسی نوکلئوتید، ۴ نوع دی دئوکسی نوکلئوتید، یک پرایمر، DNA الگو و DNA پلیمراز می‌باشد. به منظور تمایز دی دئوکسی نوکلئوتیدها از یکدیگر، از چهار رنگ فلورسنت متفاوت برای هر یک از چهار واکنش اختصاصی باز استفاده می‌شود. با انتخاب رنگ‌هایی که دارای طول موج نشری متفاوتی هستند، می‌توان هر چهار واکنش را به صورت یک نمونه در چاهک ژل وارد کرد.

تکثیر DNA الگو توسط PCR و در دستگاه Thermal cycler صورت می‌گیرد. ابتدا DNA الگو دناتوره می‌شود. سپس دما پایین آورده می‌شود تا پرایمرها متصل شوند. در نهایت دما تا حد مناسب برای فعالیت DNA پلیمراز افزایش می‌یابد تا قطعات موردنظر تکثیر یابند. حین پلیمریزاسیون، ممکن است دی دئوکسی نوکلئوتیدها متصل شده و زنجیره DNA خاتمه پیدا کند. نسبت دی دئوکسی نوکلئوتیدها به دئوکسی نوکلئوتیدها به گونه‌ای تنظیم می‌شود که توقف همانندسازی حتما در هر کدام از بازهای A، G، T و C صورت بگیرد.

پس از آن که پلیمراز از توالی الگو هزاران نسخه که هر کدام در نوکلئوتید متفاوتی خاتمه یافته‌اند، تهیه کرد، کل مخلوط در یک ستون الکتروفورز می‌شود. هنگام الکتروفورز، قطعات DNA از منبع تحریکی مانند لیزر عبور می‌کنند. در این حین، همزمان با عبور قطعات DNA از نقطه‌ای معین در ژل، سیگنال‌های فلورسنت شناسایی و ضبط می‌گردند. نتیجه، ایجاد یک intensity profile برای هر کدام از فلوروفورها است که در آن، هر کدام از چهار رنگ نشان دهنده باز متفاوتی است. همزمان اطلاعات به صورت الکترونیکی ذخیره‌سازی می‌شوند.

تکنیک‌های اولیه از ژل slab پلی آکریل آمید استفاده می‌کردند، اما با استفاده از توالی یابی capillary دانشمندان توانستند ظرفیت فرایند توالی یابی DNA را به میزان زیادی افزایش دهند. در این تکنیک نمونه‌های DNA از طریق لوله‌های شیشه‌ای موئین بلند و بسیار نازکی که قطرشان در حدود ۰.۱ میلی‌متر است و حاوی ژل پلی آکریل آمید هستند، الکتروفورز می‌شوند. انجام این کار باعث حصول به درجات بالاتری از اتوماسیون می‌گردد. برخی از ماشین‌های توالی یابی می‌توانند توالی بیش از ۳۸۴ نمونه مختلف DNA را با استفاده از لوله‌های موئین پر شده از ژل تشخیص دهند.

تکنیک توالی یابی Sanger با تغییرات جزئی که در آن ایجاد شد، به مدت سه دهه ژنتیک مولکولی را پایه‌ریزی و ژنوم انسان و بسیاری از ارگانیسم‌های دیگر را توالی‌یابی نمود. با این حال نقص‌هایی نیز داشت و از جمله مهم‌ترین آن‌ها وابستگی آن به الکتروفورز برای جداسازی قطعات جدید DNA بود. این کار نه تنها نیاز تکنیک به نیروی انسانی را افزایش می‌دهد، بلکه توالی یابی تعداد زیادی از قطعات DNA را به صورت همزمان دشوار می‌کند. درنتیجه کارایی توالی یابی محدود و تقریبا ۳۰ تا ۶۰ کیلوباز در هر ۳ تا۴ ساعت انجام الکتروفورز است. این تکنیک همچنین سرعت پایین و هزینه بالایی دارد.

 

تصویر ۴ . ماشین‌های کاملا اتوماتیک می‌توانند واکنش‌های توالی یابی دی دئوکسی را انجام دهند. در این تکنیک‌ها dNTPهای نرمال در مقادیر بالا به همراه مخلوطی از چهار نوع ddNTP مورد استفاده قرار می‌گیرند. چهار رنگ فلورسنت جداگانه به عنوان لیبل در واکنش‌های اختصاصی باز استفاده می‌شوند. لیبل‌ها می‌توانند به ddNTP اختصاصی باز اتصال یابند و یا اینکه به پرایمر متصل شوند و چهار نوع پرایمر متفاوت که چهار واکنش را از هم تمایز می‌دهند را داشته باشیم. نمونه‌های حاوی هر چهار واکنش توالی یابی توسط الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید بر اساس اندازه از همدیگر جدا می‌شوند. در این تصویر قطعات در ژل slab و در حال مهاجرت به سمت پایین نشان داده شده‌اند. همزمان با مهاجرت قطعات به سمت پایین در حین الکتروفورز، پرتو لیزر بر روی نقطه ثابتی در ژل تابیده می‌شود و این کار باعث نشر رنگ فلورسنت از قطعات DNA در حال عبور از این نقطه می‌گردد. بیشترین فلورسنت هر کدام از رنگ‌ها در طول موج‌های مختلفی رخ می‌دهد. اطلاعات به صورت الکترونیک ضبط و توالی در یک دیتابیس کامپیوتری ذخیره می‌گردد. هر قله رنگی نشانگر یک نوکلئوتید در توالی DNA است | توالی یابی چیست | تکنیک توالی یابی | sequencing | تکنیک‌های توالی یابی ژنوم | تکینک توالی یابی Sanger | توالی یابی DNA | تکنیک‌های توالی یابی نسل جدید | Next generation sequencing | توالی یابی نسل جدید | توالی یابی ۴۵۴ | توالی یابی Illumina | توالی یابی نسل سوم | تعیین توالی چیست | توالی یابی پایرو | روش های توالی یابی ژنوم | توالی یابی پروتئین | نسل جدید توالی یابی dna | توالی یابی rna | روش توالی یابی سنگر | تکنیک توالی یابی Sanger | تکنیک توالی یابی نسل جدید | تکنیک توالی یابی ۴۵۴ | تکنیک توالی یابی Illumina | تکنیک توالی یابی نسل سوم | مبانی بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک چیست . رشته بیو انفورماتیک . بیوانفورماتیک pdf . بیوانفورماتیک در ایران . رشته بیوانفورماتیک در ایران . بیوانفورماتیک به زبان ساده . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . کاربرد بیوانفورماتیک در بیوتکنولوژی ٬ مبانی بیوانفورماتیک . طراحی دارو چیست . کارگاه طراحی دارو ٬ . آموزش طراحی دارو ٬ طراحی واکسن ٬ نرم افزار های طراحی دارو ٬ طراحی دارو با کامپیوتر ٬ کتاب طراحی دارو ٬ بیوانفورماتیک pdf ٬ دانلود کتاب بیوانفورماتیک به زبان ساده فارسی . دانلود کتاب بیوانفورماتیک . دانلود رایگان کتاب بیوانفورماتیک به زبان فارسی . آموزش بیوانفورماتیک . بیوانفورماتیک دانشگاه تهران . نرم افزارهای بیوانفورماتیک . سعید کارگر تصویر ۴ . ماشین‌های کاملا اتوماتیک می‌توانند واکنش‌های توالی یابی دی دئوکسی را انجام دهند. در این تکنیک‌ها dNTPهای نرمال در مقادیر بالا به همراه مخلوطی از چهار نوع ddNTP مورد استفاده قرار می‌گیرند. چهار رنگ فلورسنت جداگانه به عنوان لیبل در واکنش‌های اختصاصی باز استفاده می‌شوند. لیبل‌ها می‌توانند به ddNTP اختصاصی باز اتصال یابند و یا اینکه به پرایمر متصل شوند و چهار نوع پرایمر متفاوت که چهار واکنش را از هم تمایز می‌دهند را داشته باشیم. نمونه‌های حاوی هر چهار واکنش توالی یابی توسط الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید بر اساس اندازه از همدیگر جدا می‌شوند. در این تصویر قطعات در ژل slab و در حال مهاجرت به سمت پایین نشان داده شده‌اند. همزمان با مهاجرت قطعات به سمت پایین در حین الکتروفورز، پرتو لیزر بر روی نقطه ثابتی در ژل تابیده می‌شود و این کار باعث نشر رنگ فلورسنت از قطعات DNA در حال عبور از این نقطه می‌گردد. بیشترین فلورسنت هر کدام از رنگ‌ها در طول موج‌های مختلفی رخ می‌دهد. اطلاعات به صورت الکترونیک ضبط و توالی در یک دیتابیس کامپیوتری ذخیره می‌گردد. هر قله رنگی نشانگر یک نوکلئوتید در توالی DNA است.