تکنیک ساترن بلات چیست؟ | ساترن بلاتینگ

ساترن بلات چیست؟

تکنیک آزمایشگاهی Southern Blotting یک روش مولکولی است که برای تشخیص و جداسازی DNA در نمونه‌های مختلف استفاده می‌شود. در این روش، DNA نمونه با استفاده از آنزیم‌های خاص بریده می‌شود و سپس با استفاده از الکتروفورز، به اندازه وزن مولکولی جدا می‌شود. سپس، DNA ها به یک صفحه نایلون یا پلی وینیلیدن فران (PVDF) منتقل می‌شوند و با استفاده از پروب‌های خاص، به دنبال جستجوی توالی‌های خاص DNA مورد نظر می‌گردند. این تکنیک برای تشخیص بیماری‌های ژنتیکی، تعیین پدیده رونویسی ژنتیکی و تحلیل DNA در تحقیقات بسیار مفید استفاده می‌شود.

چگونه می‌توان از ساترن بلاتینگ در تحقیقات مولکولی استفاده کرد؟

ساترن بلاتینگ به عنوان یک تکنیک جداسازی و تفکیک DNA در تحقیقات مولکولی استفاده می‌شود. در این روش، یون پلاتین به DNA متصل می‌شود و سپس با استفاده از الکتروفورز، DNA جدا شده و تفکیک می‌شود. همچنین، ساترن بلاتینگ در برخی از تحقیقات برای بررسی تاثیرات داروها بر روی DNA نیز استفاده می‌شود.

چه موادی برای اجرای ساترن بلاتینگ نیاز است؟

برای اجرای ساترن بلاتینگ، نیاز به یون پلاتین، DNA و مواد شیمیایی مثل NaCl و Tris-HCl است.

چگونه می‌توان نمونه‌های DNA را با استفاده از ساترن بلاتینگ جداسازی کرد؟

برای جداسازی DNA با استفاده از ساترن بلاتینگ، نمونه DNA با یون پلاتین ترکیب شده و سپس با استفاده از الکتروفورز، DNA جدا شده و تفکیک می‌شود.

آیا ساترن بلاتینگ به عنوان یک روش تشخیص بیماری‌های ژنتیکی نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد؟

ساترن بلاتینگ به عنوان یک روش تشخیص بیماری‌های ژنتیکی مورد استفاده قرار نمی‌گیرد، اما به عنوان یک دارو در درمان برخی از بیماری‌های سرطانی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

این تکنیک ژنتیک مولکولی، برای نخستین بار در سال ۱۹۷۵ و توسط Edwin Southern معرفی شد و هدف از انجام آن، تشخیص واریانت‌های ژنتیکی بود. کاربرد مهم هیبریداسیون ساترن بلاتینگ در تعیین توالی‌های هدفی است که مشابه ژن مورد استفاده به عنوان پروب هستند، اما دقیقا با آن یکسان نمی‌باشند. به عبارت دیگر، این تکنیک‌ به منظور تعیین میزان قرابت توالی‌های DNA یک منبع با منبعی دیگر استفاده می‌شود.

توالی‌های هدف می‌توانند جزئی از خانواده ژ‌ن‌های مرتبط با یکدیگر از لحاظ تکاملی، توالی‌های DNA موجود در داخل یک ژنوم و یا دقیقا معادلی برای پروبی در داخل ژنومی دیگر ‌باشند. در مورد آخر، ژنوم‌ها می‌توانند از افراد مختلف یک گونه و یا از گونه‌های متفاوتی تهیه شوند. پس از این که با استفاده از این روش، مرتبط بودن پروب استخراج شده به سایر توالی‌های ناشناخته معین شد، می‌توان سایر اعضای خانواده ژنی را با بررسی کتاب‌خانه‌های DNA مناسب، مشخص نمود.

ساترن بلاتینگ، متشکل از ایجاد هیبرید بین مولکول‌ها DNA منشا گرفته از دو منبع مختلف بوده و دارای دو جزء اساسی است: توالی پروب (ژن دلخواه موجود در یک ارگانیسم) و توالی هدف (توالی DNA موجود در ارگانیسمی دیگر که باید ابتدا استخراج شود). تمرکز اصلی این تکنیک و نخستین گام آن، جداسازی DNA ژنومی با آنزیم‌های محدودکننده می‌باشد. ممکن است یک یا چند آنزیم محدودکننده به این منظور استفاده شوند و قطعات ایجاد شده طولی از صدها تا هزاران جفت‌باز (۵۰۰ تا ۱۰۰۰۰) خواهند داشت.

قطعات DNA ایجادشده، سپس توسط الکتروفورز در ژل آگارز از همدیگر تفکیک می‌شوند. هر چه اندازه قطعه بزرگتر باشد، وزن مولکولی آن بیشتر و سرعت حرکت آن در ژل آهسته‌تر خواهد بود. هدف ما از انجام این کار، استفاده از پروب و تعیین قطعاتی است که حاوی ژن موردنظر می‌باشند. این کار را می‌توان هنگام حضور قطعات در ژل نیز انجام داد؛ اما معمولا موثر نیست. زیرا ماتریکس ژل باعث هیبریداسیون‌های نادرست فراوانی می‌شود که سیگنال‌های مربوط به هیبریداسیون‌های اختصاصی را پوشش می‌دهد. در عوض نوارهای DNA موجود در ژل به غشای نیتروسلولزی یا نایلونی انتقال داده می‌شوند و درنتیجه محیطی با آلودگی کمتر به منظور انجام دقیق‌تر واکنش‌های هیبریداسیون فراهم می‌گردد.

تکنیک ساترن بلاتینگ | تکنیک Southern blotting | صویر ۱. انتقال مولکول‌های DNA تک‌رشته‌ای از ژل به غشا توسط capillary action؛ فیلتر کاغذی با استفاده از capillary action بافر را از راه غشا و ژل، از محفظه جذب می‌کند و به حوله‌های کاغذی انتقال می‌دهد. با حرکت مایع بافر، مولکول‌های DNA تک‌رشته‌ای نیز از ژل حرکت می‌کنند و به غشا می‌چسبند. وزنه‌ای که بر روی این مواد قرار گرفته است، غشا و ژل را در تماس پیوسته با یکدیگر قرار داده و به جذب مایع از محفظه کمک می‌کند.

پس در گام دوم، DNA توسط مواد بازی دناتوره (یا انکوباسیون ژل در اسید قوی)، از ژل به یک غشای نیتروسلولزی یا نایلون منتقل و توسط پرتوهای فرابنفش ثابت می‌گردد. در واقع در این مرحله است که عمل بلاتینگ یا لکه‌گذاری به انجام می‌رسد. انتقال مولکول‌های DNA تک‌رشته‌ای به غشا توسط capillary action صورت می‌گیرد. مولکول‌های DNA پس از انتقال به غشا نیز تک‌رشته‌ای می‌مانند.

پس از این مرحله، پروب‌های کوتاه، تک‌رشته‌ای و لیبل‌شده (مثلا cDNA های کلون‌شده از یک ژن)، با غشای حاوی مولکول‌های DNA تک‌رشته‌ای انکوبه می‌شوند. انکوباسیون در دمایی انجام می‌گیرد که باعث هیبریداسیون مولکول‌های DNA به صورت اختصاصی و با کمترین میزان mismatch شود. بسته به میزان موردانتظار از قرابت توالی پروب و هدف، دما و درنتیجه میزان mismatch قابل تحمل، می‌تواند تغییر کند. در دماهای بالا، پروب تقریبا به توالی‌های کاملا منطبق متصل خواهد شد. این در حالی است که در دماهای پایین، پروب ممکن است به جایگاه‌هایی با چندین mismatch اتصال یابد. تمام اتصالات غیراختصاصی پس از شست‌وشوی پایه از هم گسسته خواهند شد.

---

مقاله های مرتبط :

تکنیک های بلاتینگ

تکنیک نوردرن بلات

تکنیک ساترن بلاتینگ

---

لیبل کردن مولکول‌های پروب می‌تواند با استفاده از مواد رادیواکتیو مانند ^۳۲P، بیوتین و یا دیگوکسی‌ژنین انجام بگیرد. در صورتی که پروب رادیواکتیو باشد، از فیلم عکاسی استفاده می‌شود. در صورتیکه پروب با بیوتین و یا دیگوکسی‌ژنین لیبل شود، غشا ابتدا باید تحت تاثیر سوبسترای chemiluminescent قرار بگیرد تا هیبریدهای تشکیل شده بین پروب و مولکول هدف مشخص شوند و سپس آن را در معرض فیلم عکاسی قرار دهیم. این روش‌های غیررادیواکتیو، ایمن‌تر و سریع‌تر می‌باشند. البته لیبل‌های بیوتین یا دیگوکسی‌ژنین می‌توانند با قرار گرفتن تحت تاثیر مواد کروموژن نیز مشاهده شوند.

درنتیجه قرار دادن غشا در معرض فیلم، موقعیت پروب‌های اتصال یافته به توالی‌های هومولوگ به صورت  الگوی خاصی از نوارها تشکیل می‌شود که منطبق بر قطعات ژنومی نشان‌دهنده پروب مورداستفاده می‌باشند. از آن‌جایی که ثابت شدن DNA روی غشا دقیقا به ترتیبی که در ژل وجود داشت صورت می‌گیرد، طول نوارها نشان دهنده اندازه قطعات DNA خواهد بود. در صورت استفاده از مواد کروموژن در روش غیر رادیواکتیو، معمولا نوارهای آبی موقعیت هیبریدهای موردنظر را نشان خواهند داد.

تکنیک نوردن بلاتینگ | Northern Blotting | تصویر ۲ . نمودار تکنیک Southern blot؛ این نمودار نشان‌دهنده تفکیک قطعات DNA بر اساس اندازه توسط الکتروفورز، دناتوراسیون مولکول‌‌های DNA دورشته‌ای و تبدیل آن‌ها به مولکول‌های تک‌رشته‌ای، انتقال مولکول‌ها به فیلتر نیتروسلولزی و هیبریداسیون آن‌ها با پروب‌های DNA لیبل‌شده با ۳۲P می‌باشد.‌

در صورتیکه جایگاه تشخیص آنزیم محدودکننده مشخصی در ژن درنتیجه پلی‌مورفیسم یا جهشی بیماری‌زا تغییر یافته باشد، الگوی نوارها در آنالیز ساترن بلاتینگ پروب مورد بررسی تغییر خواهد یافت. این فرایند به RFLP (Restriction fragment length polymorphism) معروف است. سال‌ها پیش از اختراع تکنیک PCR، تشخیص دقیق جهش‌های نقطه ای توسط ساترن بلاتینگ انجام می‌شد. امروزه این متد پیچیده دیگر برای شناسایی واریانت‌های ساده ژنتیکی استفاده نمی‌شود (PCR به طور موثرتری این کار را انجام می‌دهد). البته ساترن بلاتینگ همچنان در شناسایی تغییرات اساسی‌تر در طول DNA، مانند بیماری‌های تکرار سه‌تایی (trinucleotide repeat diseases)، روش انتخابی محسوب می‌گردد.

تکنیک ساترن بلاتینگ | تکنیک Southern blotting | تصویر ۳ . تشخیص متیلاسیون پروموتر FMR1 در بیماران مبتلا به سندروم X شکننده؛ DNA توسط EcoR1 هضم و آنزیم حساس به متیلاسیون Bst Z1 به پروب Ox1.9 اتصال داده شد.

تکنیک ساترن بلاتینگ تکنیک Southern blotting | تصویر ۷ . آنالیز مولکولی سندروم X شکننده با هضم DNA ژنومی به صورت مستقل از متیلاسیون و آشکارسازی با Southern blotting انجام می‌گیرد. تقریب در تمام موارد سندروم X شکننده، توسعه تکرارهای CGG در ژن FMR1 انجام می‌گیرد که در صورت بیش از حد بودنشان، ژن خاموش می‌شود (متیلاسیون). در صورتیکه تعداد تکرارهای CGG بین ۵۵ تا ۲۰۰ بار باشد، حالت premutation رخ داده است. در مردان تنها یک الل از این ژن وجود دارد، که در حالت نرمال و یا در افراد با premutation، متیله نشده و در افراد با جهش کامل، متیله شده است. زنان دارای دو الل هستند (کروموزوم X فعال و غیرفعال)؛ درنتیجه دارای دو نوع نوار هستند که هر دو نسخه متیله‌شده و متیله نشده ژن را نشان می‌دهد. در حالت جهش کامل همواره متیلاسیون مشاهده