وکتورهای کلونینگ

وکتورهای کلونینگ

یک حامل یا وکتور کلونینگ قطعه ای از DNA است که از ویروس یا پلاسمید گرفته شده و می توان در آن یک قطعه DNA خارجی را طی فرایندی به نام کلونینگ وارد نمود. همانطور که گفته شد پلاسمیدها مولکول های DNA دورشته ای حلقوی به فرم سوپرکویل بوده که قابلیت همانندسازی مستقل از DNA باکتریایی را داشته و به طور پایدار به صورت خارج کروموزومی به سلول های دختری به ارث می رسند. فاژها، ویروس هایی هستند که به طور اختصاصی باکتری ها را آلوده می کنند.

فاژها مانند سایر ویروس ها ساختمان بسیار ساده ای دارند و فقط از یک مولکول DNA (یا گاهی اوقات RNA) تشکیل شده اند که چندین ژن، از جمله ژن هایی برای همانندسازی فاژ را حمل می کنند و توسط یک پوشش محافظ یا کپسید از جنس مولکول های پروتئین احاطه می شوند. باکتریوفاژهایی که بطور معمول برای کلونینگ در E.coli استفاده می شوند فاژها و M13 هستند.

خصوصیات وکتورهای کلونینگ

یک وکتور کلونینگ بطور معمول شامل:

۱- مبدا همانندسازی مستقل (Ori) است تا بتواند در داخل باکتری تکثیر یابد.

۲- حداقل یک مارکر انتخاب می باشد که توسط این مارکر می توان باکتری های دریافت کننده وکتور را از سایر باکتری ها تشخیص داد. اغلب مارکرهای انتخابی در باکتری ها، ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک هایی مثل کانامایسین، پنیسیلین و آمپی سیلین می باشند.

۳- مکان برش منحصر به فرد برای آنزیم های برشی محدودالاثر یا همان مکان کلونینگ” برای وارد کردن DNA خارجی می باشد.

وک

تورهای با کپی بالا

حضور مبدآ همانندسازی باکتریایی در یک وکتور ضروری است، زیرا لازم است تا از تکثیر در باکتری اطمینان حاصل شود. بسیاری از وکتورها حامل نقطه شروعی هستند که از پلاسمید CoIE1 در E.coli مشتق شده اند مانند pBR322-Ori یا pUC-Ori.

این “وکتورهای با کپی بالا” میزان بالای تکثیرشان حتمی است زیرا همانندسازی آنها به کروموزوم باکتری وابسته نیست. مقاومت در برابر آنتی بیوتیک ها به منظور انتخاب باکتری های ترنسفورم شده استفاده می شود. همانطور که ذکر شد ژن های حامل مقاومت که اغلب مورد استفاده قرار می گیرند Amp و Kan هستند. ژن مقاومت به آمپی سیلین آنزیم B-لاکتام آمیدوهیدرولاز (B-لاکتاماز) را کد میکند، که آمپی سیلین و پنی سیلین را به اجزاء هضم شده بی اثر می شکند.

ژن مقاومت به آنتی بیوتیک :

استفاده از آمپی سیلین برای انتخاب باکتری ترنسفورم شده، معمولاً روش کارآیی است. در روش دیگر، آنتی بیوتیک پایدارتر کاربنیسیلین” می تواند مورد استفاده قرار گیرد. ژن مقاومت به کانامایسین یک آنزیم فسفوریله کننده را کد میکند که کانامایسین – یک آنتی بیوتیک که در دماهای بالا بسیار پایدارتر از آمپی سیلین است – را غیر فعال میکند. این  آنتی بیوتیک حتی در برابر اتوکلاو شدن نیز مقاوم است. توجه کنید که غلظت های بیش از اندازه کانامایسین اثر انتخابی به شدت منفی دارد که می تواند رشد باکتری ترنسفورم شده را ضعیف یا مختل کند. همه وکتورها دارای تعداد معینی از جایگاه های شناسایی آنزیم های محدود کننده ای می باشند که توالی وکتور را تنها یکبار برش می دهند (برش دهنده های تک جایگاهی) تا کلونینگ یک قطعه DNA را میسر سازند. ممکن است یک وکتور حاوی بیش از ۲۵ جایگاه برش برای آنزیم های محدود کننده تک برشی باشند. در مورد باکتری اشریشیا کلای امروزه وکتورهای تجاری متعددی وجود دارد.

نویسنده : سعید کارگر

وکتورهای کلونینگ

وکتورهای کلونینگ