توضیحات

امروزه برای استخراج RNA از سلول های باکتریایی از ماده Trizol استفاده می کنند. این روش که توسط Chomczynski و Sacchi، در سال 1987 ابداع شد متداول ترین روش است. اگرچه مدت زمان این روش نسبت به بسیاری از روش های تجاری در دسترس، اندکی بیشتر است اما این روش ظرفیت بالایی برای بازدهی هرچه بیشتر RNA را دارد. با استفاده از بافر chaotrophic lysis این روش به عنوان روشی برای بدست آوردن با کیفیت ترین RNA در نظر گرفته می شود.

RNA ماده ای پلی مریک است که شامل زنجیره ای تک رشته ای و طویل دارای واحدهای فسفات، قند ریبوز و بازهای آمینه آدنین، گوانین، سیتوزین و یوراسیل است. RNA در تمامی مراحل سنتز پروتئین در تمامی سیستم های دارای حیات، استفاده می شود. بنابراین جداسازی و شناسایی بیشتر این مولکول، ویژگی های برجسته و مهم مربوط به سنتز پروتئین و آنالیز بیان ژن را نشان می دهد. از این رو، جداسازی مولکول RNA با کیفیت بالا، مهم ترین مرحله در مطالعات متنوع زیست شناسی مولکولی است. بدین منظور، تریزول، آماده استفاده به عنوان محلول جداسازی RNA از سلول ها و بافت ها می باشد. عملکرد تریزول در واقع از طریق یکنواختی و یا همگن نگه داشتن RNA در طول مدت همگن سازی بافت و همچنین در دیگر روش های استخراج مشابه است. به طور همزمان، غشای سلولی و دیگر محتویات سلولی را تخریب می کند. افزودن کلروفرم همیشه به منظور جداسازی راحت تر RNA  در فاز آبی، محلول را به دو فاز جداگانه یعنی فاز آبی و فاز ارگانیک (آلی)، تقسیم می کند.

در فاز آبی، مقدار بیشتری از RNA را می توان با استفاده از رسوب گذاری با ایزوپروپیل الکل، جداسازی کرد. علاوه بر این، DNA و پروتئین ها را می توان با جداسازی های پی در پی از فاز آبی حذف کرد. حاصل رسوب گذاری از فاز بینابینی با اتانول، DNA بوده و برای رسوب گذاری بیشتر با ایزوپروپیل الکل، به پروتئین های درون فاز آلی نیاز است. (شکل 1.4). از آنجایی که تریزول باعث ایجاد RNA خالص و عاری از هر گونه آلودگی پروتئینی و DNA، می شود، بنابراین از آن می توان در عملیات پایین دستی بیشتری مانند آنالیزهای نورترن بلات، ترجمه در محیط آزمایشگاهی، انتخاب دم پلی A، سنجش حفاظت از RNase و همچنین کلونینگ مولکولی، نیز استفاده کرد.

استخراج RNA از هر سیستم زنده ای به دلیل حضور آنزیم های ریبونوکلئاز در جای جای سلول، با مشکل مواجه می شود. بنابراین، جداسازی RNA با کیفیت بالا، شرط لازم پیش از انجام هر گونه آزمایش در زمینه زیست شناسی مولکولی، مانند PCR کمی ، است. به منظور حصول دقیق ترین و شفاف ترین نتایج، عمل جداسازی RNA، باید شامل موارد مهمی پیش از استخراج واقعی، در طول استخراج، و پس از آن باشد. بنابراین به منظور جداسازی مؤثر RNA باکتریایی، باید سه جنبه مهم را در نظر گرفت، این موارد شامل: 1- تیمار و نگهداری نمونه ها قبل از استخراج RNA، 2- انتخاب روش و تکنیک برای جداسازی RNA ، و 3- نگهداری نمونه های RNA آماده شده، می باشد.