PCR رونویسی معکوس | RT- PCR | Reverse Transcription-PCR
این تکنیک آشکارسازی کمی مقدار بیان RNA را به وسیله تولید DNA مکمل (cDNA) از RNA با کمک آنزیم رونوشت بردار معکوس و به دنبال آن تکثیر cDNA با استفاده از PCR استاندارد را ممکن می سازد. Howard Temin از دانشگاه Wisconsin–Madison، آنزیم رونوشت بردار معکوس را در ویروس روس سارکوما (RSA) کشف کرد که بعدا به طور مستقل توسط David Baltimore در سال 1970 از دو ویروس توموری RNAدار R-MLV (ویروس لوکمی رائوسچر مورین) و RSV جدا سازی شد. هردو دانشمند در سال 1975 به طور مشترک جایزه نوبل فیزیولوژی یا پزشکی را به خاطر دستاوردهای فوق الذکر دریافت کردند.
آنزیم رونوشت بردار معکوس شامل یک DNA پلیمراز وابسته به RNA، یک فعالیت DNA پلیمرازی وابسته به DNA و ریبونوکلئازH هستند که جهت انجام رونویسی با هم عمل می کنند. علاوه بر عملکرد در فرآیند رونویسی، آنزیم های رونوشت بردار رتروویروسی دارای یک دومین متعلق به خانواده RNase H هستند که جهت همانندسازی آنها حیاتی هست. ایده رونویسی معکوس در ابتدا زیاد مورد استقبال قرار نگرفت زیرا هسته مرکزی بیولوژی مولکولی (Central Dogma)
را نقض می کرد اما سرانجام در سال 1970 زمانی که David Baltimore و Howard Temin به طور ، مستقل آنزیم مسئول رونویسی معکوس به نام رونوشت بردار معکوس را کشف کردند، پذیرفته شد.
رونوشت بردارهای معکوس رتروویروسی مانند ویروس میلوبلاستوزیس ماکیان (AMV) و ویروس لوکمی موش مولونی (MMLV) از رونوشت بردارهای بسیار شناخته شده هستند که در زمینه بیولوژی مولکولی استفاده می شوند. رونوشت بردار معکوس بسیار رایج برای الگوهای طویل mRNA رونوشت بردار معکوس M-MLV است زیرا فعالیت RNase H آن ضعیف تر از رونوشت بردار معکوس AMV (که به طور معمول استفاده می شود) می باشد. پیشرفت در زمینه مهندسی ژنتیک و گسترش بافرهای افزاینده فعالیت ترانسکریپتازی (RT) سبب دسترسی آنزی مهاری جدیدی شد که کارایی بالاتری نسبت به ترانسکریپتازهای طبیعی داشته و دارای مقادیر بالای مقاومت حرارتی و عمر مفید طولانی در 50 درجه سانتیگراد هستند.
امروزه رونوشت بردار معکوس M-MLV مورد استفاده از اشریشیاکلی تلخیص می شود که ژن M-MLV، pol بر روی پلاسمید را بیان می کند. درحالی که سلول های حشرات عفونی شده با باکولوویروس دارای ژن pol ویروس میلوبلاستوزیس ماکیان (AMV) جهت تلخیص رونوشت بردار معکوس AMV استفاده می شوند.
PCR رونویسی معکوس
انواع روش های انجام RT-PCR
دو روش مقدماتی برای انجام RT-PCR وجود دارد یعنی روش یک مرحله ای و دو مرحله ای. در روش یک مرحله ای، تمام اجزا شامل پرایمرهای اختصاصی در داخل یک لوله منفرد گذاشته شده و به همان صورت واکنش PCR صورت می گیرد. در روش دو مرحله ای، واکنش اول شامل تشکیل cDNA با کمک واکنش مجزای ترانسکریپتاز معکوس است سپس cDNA به واکنش PCR اضافه می شود.
روش یک مرحله ای بسیار سودمند است زیرا زمان کمی می برد و ارزان بوده و نیاز کمی به دستکاری نمونه ها دارد بنابراین خطای پیپت کردن، آلودگی و غیره کاهش می یابد. با این وجود مشکل آنالیز بعدی ژن های هدفی است که به وسیله پرایمرهای ویژه ژن مورد استفاده در واکنش تک لوله ای جهت تشکیل و تکثیر cDNA تکثیر نشده اند؛ بنابراین کسری RNA از نمونه های اصلی باید جهت آزمون بیشتر ذخیره شوند؛ اما انجام روش دو مرحله ای این مزیت را دارد که در این روش نمونه RNA در یک مرحله استفاده نمی شود و آنالیز بیشتر ژن هدف را امکان پذیر می سازد.
