تکنیک ساترن بلات

این تکنیک در دهه 1970 توسط دانشمندی به نام Southern Blot برای شناسایی قطعاتی که مکمل یک توالی DNA یا RNA موردنظر بر روی ژل بودند به کار رفت .

پس از برش DNA توسط آنزیم محدودالاثر ، قطعات حاصل از برش بر روی ژل را الکتروفورز می کنیم که قطعات بر اساس اندازه روی ژل از هم جدا می شوند .قطعات بزرگتر چون آهسته تر حرکت می کنند بالاتر از قطعات کوچکتر قرار می گیرند . قطعات DNA روی ژل بوسیله تیمار با قلیا واسرشت و به شکل تک رشته ای در می آیند . نسخه دائمی از این قطعات تک رشته با انتقال آنها روی فیلتر نیتروسلولوزی که DNA به آن متصل می شود ، بدست می آید که به آن ساترن بلات گفته می شود.

قطعه DNA خاص موردنظر از میان مجموعه قطعات متصل به فیلتر را می توان با پروب نشاندار شده ی رادیواکتیو که تک رشته ای شده است و برای دورگه سازی در مجاورت قطعات موجود روی فیلتر قرار داده می شود و متعاقب آن با انجام اتورادیوگرافی آشکار نمود .

روش های ساترن بلات غیر رادیواکتیو با استفاده از DNA پروب های نشاندار شده با دیگوکسیژنین (digoxigenin) ایجاد شده اند که توسط کمی لومینسانس آشکارسازی می شوند .

تایید تست تشخیص کرونا ویروس در 45 دقیقه توسط FDA سازمان جهانی دارو و غذا آمریکا تست Coronavirus rapid COVID-19 کروناویروس

تایید تست تشخیص کرونا ویروس در 45 دقیقه توسط FDA

☑️تایید تست تشخیص کرونا ویروس در 45 دقیقه توسط FDA

سازمان جهانی دارو و غذا آمریکا، تست Coronavirus rapid که می تواند COVID-19 را در 45 دقیقه تشخیص دهد تایید کرد. این تست که توسط شرکت California-based Cepheid انجام شده، 8 روز پس ازاینکه شرکت Roche اعلام کرد تشخیص کروناویروس در طی سه ساعت را امکان پذیر کرده است ارائه شد. شرکت thermos fisher نیز در بازار کیت تشخیص کرونا را ارائه داده است.
تست Cepheid هفته آینده دربیمارستانها مورد استفاده قرار می گیرد. نتیجه آزمایش دقیق که به بیمار ارائه می شود می تواند تحول آمیز باشد و به کاهش فشارهای ایجاد شده با شیوع 2019-nCoV بر روی مراکز درمانی جهت تشخیص سریع، کمک کند.

تایید تست تشخیص کرونا ویروس در 45 دقیقه توسط  FDA سازمان جهانی دارو و غذا آمریکا  تست Coronavirus rapid  COVID-19 کروناویروس
تایید تست تشخیص کرونا ویروس در 45 دقیقه توسط FDA

رفرنس :

https://www.sciencealert.com/fda-just-approved-a-rapid-new-test-that-can-diagnose-covid-19-in-45-minutes

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (به انگلیسی: Polymerase Chain Reaction) که مخفف آن PCR می‌باشد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) تکنیکی در زیست‌شناسی مولکولی است

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز | Polymerase Chain Reaction

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (به انگلیسی: Polymerase Chain Reaction) که مخفف آن PCR می‌باشد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) تکنیکی در زیست‌شناسی مولکولی است و به منظور تکثیر یک نسخه منفرد یا نسخه‌های کمی از یک قطعه DNA با توالی خاص به تعداد هزار یا میلیون‌ها نسخه به کار می‌رود. این تکنیک ابزاری آسان و ارزان قیمت برای تکثیر یک قطعه خاص از DNA است و برای اهدافی همچون تشخیص و نظارت بر بیماری‌های ژنتیکی، شناسایی مجرمان (در زمینهٔ پزشکی قانونی) و مطالعه عملکرد یک بخش هدف از DNA مورد استفاده قرار می‌گیرد.[۱]

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
این تکنیک در سال 1983 بوسیله کری مالیس ابداع شد[۲][۳]). هم‌اکنون PCR یک تکنیک متداول و اغلب ضروری در آزمایشگاه‌های بالینی و آزمایشگاه‌های تحقیقاتی است و در موارد گوناگونی کاربرد دارد.[۴][۵] این کاربردها شامل کلون‌کردن DNA برای توالی یابی، فیلوژنی بر پایه DNA، آنالیز عملکرد ژن‌ها، تشخیص بیماری‌های ارثی، شناسایی اثر انگشت ژنتیکی (مورد استفاده در علم پزشکی قانونی) و تشخیص عوامل بیماری‌زا در تست‌های نوکلئیک اسید برای تشخیص بیماری‌های عفونی است. در سال ۱۹۹۳ مولیس همراه با مایکل اسمیت جایزه نوبل شیمی را برای کار روی PCR دریافت کردند.[۶]

اساس تکنیک PCR چرخه‌های حرارتی است. این چرخه‌ها شامل چرخه‌های گرمایی و سرمایی تکراری، ذوب DNA و تکثیر آنزیمی DNA است. پرایمرها (قطعات کوتاه DNA) که حاوی توالی مکمل ناحیه هدف اند به همراه یک DNA پلیمراز، اجزای اصلی واکنش PCR برای انتخاب و تکثیر قطعه مورد نظر را تشکیل می‌دهند. طی فرایند PCR الگوی DNA به صورت لگاریتمی تکثیر می‌شود و DNA تکثیر شده خود به عنوان الگویی برای همانندسازی استفاده می‌شود. PCR می‌تواند به شکل گسترده‌ای برای انجام مراحل مختلف در دستکاری‌های ژنتیکی استفاده شود.

تقریباً در تمام کاربردهای PCR از یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند تک پلیمراز (آنزیمی که از باکتری Thermus aquaticus جداسازی شده) استفاده می‌شود. این DNA پلیمراز از یک DNAی تک‌رشته‌ای به عنوان الگو استفاده کرده و با کمک پرایمرها و با به‌کارگیری نوکلئوتیدها که بلوک‌های ساختاری DNA هستند، یک رشته DNAی جدید می‌سازد. در اغلب روش‌های PCR از چرخه‌های حرارتی یعنی گرم و سرد کردن متناوب نمونه‌های PCR طبق مراحل دمایی مشخص استفاده می‌شود.

در مرحله اول، دو رشتهٔ مارپیچ DNA دورشته‌ای در یک دمای بالا، در فرآیندی که ذوب DNA نامیده می‌شود از یکدیگر جدا می‌شوند. در مرحله دوم، دما پایین آورده شده و و هریک از دورشته DNA به عنوان الگو عمل می‌کنند. ساخته شدن رشته جدید از روی الگو توسط DNA پلیمراز انجام می‌شود. پرایمرها بر اساس توالی قطعه‌ای از DNA که موردنظر ماست طراحی می‌شوند.

اصول
PCR یک ناحیه خاص از رشته DNA هدف را تکثیر می‌کند. به‌طور معمول اکثر روش‌های PCR این قابلیت را دارند تا قطعات DNA بین ۱/۰ و ۱۰ کیلوجفت باز (kbp) را تکثیر کنند. هرچند تکنیک‌های دیگر می‌توانند قطعاتی با اندازه‌های بالاتر از ۴۰ کیلوجفت باز را نیز تکثیر کنند.[۷] مقدار تکثیر محصول بوسیله سوبسترای موجود در واکنش که پیشرفت واکنش را محدود می‌کند تعیین می‌شود.[۸]

یک واکنش PCR پایه‌ای نیازمند چندین جزء است.[۹] این اجزاء شامل موارد زیر است:

دی ان ای الگو که حاوی ناحیه DNA ی هدف برای تکثیر است.
تگ پلیمراز که یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت است[۱۰]
دو پرایمر DNA که مکمل انتهای ۳’ رشته‌های سنس و آنتی سنس DNA ی الگو هستند (بدون پرایمرها، جایگاه آغاز دورشته‌ای که DNA پلیمراز بتواند به آن متصل شود شناخته نمی‌شود).[۱۱] پرایمرهای خاصی که مکمل DNA هدف هستند از قبل انتخاب شده و به شکل سفارشی در آزمایشگاه ساخته یا از تأمین کنندگان خریداری می‌شوند.
دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته یا dNTPs بلوک‌های ساختاری هستند که DNA پلیمراز با استفاده از آن‌ها رشته‌های جدید را می‌سازد.
یک محلول بافری که محیط شیمیایی مناسبی برای بهبود فعالیت و پایداری DNA پلیمراز فراهم می‌کند.
کاتیون‌های دوظرفیتی مانند منیزیوم (Mg) یا منگنز (Mn)؛ کاتیون Mg2+ متداول‌تر است. همچنین کاتیون Mn2+ می‌تواند برای جهش زایی DNA ی حاصل از PCR استفاده شود و غلظت بالای این یون نرخ خطا را در طول سنتز افزایش می‌دهد.[۱۲]
کاتیون‌های تک ظرفیتی، معمولاً یون‌های پتاسیم (K)
بافر 10X
واکنش معمولاً در حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله‌های کوچک واکنش (با حجم ۲/۰–۵/۰ میلی لیتر) و در یک چرخه حرارتی انجام می‌شود. چرخه‌های حرارتی لوله‌های واکنش را به منظور فراهم کردن دمای لازم در هر مرحله سرد و گرم می‌کنند. بسیاری از چرخه‌های حرارتی پیشرفته از اثر پلتیر Peltier effect که اجازه گرم و سرد کردن لوله‌های PCR را بوسیله معکوس کردن جریان الکتریکی می‌دهد استفاده می‌کنند.

روش
به‌طور کلی PCR شامل مجموعه‌ای از ۴۰–۲۰ بار تغییر دمایی تکرارشونده به نام سیکل است که هر سیکل متداولاً از دو یا سه مرحله دمایی مستقل تشکیل شده‌است.[۱۳] مراحل مشترک اغلب روش‌های PCR عبارت است از:

نشانگر ژنتیکی یک جاندار با استفاده از واکنش‌زنجیره‌ای‌پلیمراز
آغاز: این مرحله برای DNA پلیمرازی که نیازمند فعالسازی گرمایی بوسیله Hot-start PCR است[۱۴] لازم می‌باشد و شامل گرم کردن محفظه واکنش تا دمای ۹۶–۹۴ درجه سانتی گراد (۲۰۵–۲۰۱ درجه فارنهایت) یا ۹۸ درجه سانتی گراد (۲۰۸ درجه فارنهایت) برای پلیمرازهای بسیار مقاوم به حرارت است. این مرحله ۱۰–۱ دقیقه به طول می‌انجامد.
دناتوراسیون: این مرحله اولین مرحله سیکل است و شامل گرم کردن محفظه واکنش تا ۹۸–۹۴ درجه سانتی گراد (۲۰۸–۲۰۱ درجه فارنهایت) به مدت ۳۰–۲۰ ثانیه می‌شود که بوسیله شکستن پیوندهای دورشته‌ای بین بازهای مکمل باعث ذوب شدن یا دناتوراسیون DNA الگوی دورشته‌ای شده و به این ترتیب دو مولکول DNA تک رشته‌ای حاصل می‌شود.
اتصال: در این مرحله دمای واکنش به مدت ۴۰–۲۰ ثانیه به ۶۵–۵۰ درجه سانتی گراد کاهش می‌یابد که باعث می‌شود پرایمرها به هریک از الگوهای تک رشته DNA متصل شوند. اتصال معمولاً حدود ۵–۳ درجه سانتی گراد زیر دمای ذوب(Tm پرایمرها انجام می‌شود. در طول این فرایند DNA پلیمراز به ترکیبی از الگو و پرایمر متصل و شروع به ایجاد رشته‌های جدید می‌کند).
گسترش/ طویل شدن: در این مرحله دما برای عملکرد DNA پلیمراز لازم است؛ دمای بهینه یک DNA پلیمراز ۸۰–۷۵ درجه سانتی گراد است. با این وجود معمولاً دمای ۷۲ درجه سانتی گراد برای این آنزیم استفاده می‌شود[۱۵][۱۶]). در این مرحله DNA پلیمراز یک رشته DNA ی جدید که مکمل رشته الگو است را در جهت ’۵ به ’۳ سنتز می‌کند. زمان لازم برای افزایش طول بستگی به DNA پلیمراز استفاده شده و طول ناحیه DNA ی هدف برای تکثیر دارد.
فرآیندهای دناتوراسیون، اتصال و طویل شدن یک سیکل را تشکیل می‌دهند. برای تکثیر DNA ی هدف تا میلیون‌ها نسخه، سیکل‌های متعددی نیاز است.

طویل شدن نهایی: این تک مرحله اختیاری است و پس از آخرین سیکل PCR برای اطمینان از طویل شدن کامل هر تک رشته DNA در یک دمای ۷۴–۷۰ درجه سانتی گراد (۱۶۵–۱۵۸ درجه فارنهایت) به مدت ۱۵–۵ دقیقه انجام می‌شود.
نگهداری نهایی: مرحله نهایی سرد کردن محفظه واکنش تا ۱۵–۴ درجه سانتی گراد برای یک زمان نامحدود است و ممکن است این مرحله برای ذخیره‌سازی کوتاه مدت محصولات PCR استفاده شود.
به منظور بررسی میزان موفقیت PCR انجام شده از الکتروفورز بر روی ژل (به منظور جداسازی محصولات PCR و بررسی اندازه قطعات استفاده می‌شود.

در طراحی پرایمربرای واکنش PCR باید نکات خاصی در نظر گرفته شود مثلاً حتماً قسمت ۳پریم از پرایمر می‌بایست مکمل بخش هدف باشد که این برای بخش ۵ پریم الزامی نمی‌باشد همچنین باید در نظر گرفته شود که دو پرایمر حداقل توالی مکمل یکدیگر را داشته باشند و توالی‌های مستعد تشکیل سنجاق سری هم در آن‌ها تا حد معمول استفاده نشود. معمولاً از گرم کردن و سرد کردن مخلوط واکنش برای جدا شدن دو رشته DNA و چسبیدن آغازگرها یا Annealing استفاده می‌شود. در نتیجه این چرخه‌ها میلیون‌ها نسخه از قطعه کوتاهی از DNA تولید می‌شود.

منابع

  1. ↑ 1. “PCR”. Genetic Science Learning Center, University of Utah.
  2. ↑ 2. Jump up^ Bartlett, J. M. S. ; Stirling, D. (2003). “A Short History of the Polymerase Chain Reaction”. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 226 (2nd ed.). pp. 3–6. doi:10.1385/1-59259-384-4:3. شابک ‎۱-۵۹۲۵۹-۳۸۴-۴.
  3. ↑ 3. Jump up^ Mullis, Kary B. et al. “Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences” U.S. Patent 4,683,195
  4. ↑ 4. ^ Jump up to:a b c Saiki, R. ; Scharf, S. ; Faloona, F. ; Mullis, K. ; Horn, G. ; Erlich, H. ; Arnheim, N. (1985). “Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia”. Science. 230 (4732): 1350–1354. doi:10.1126/science.2999980. PMID 2999980.
  5. ↑ 5. ^ Jump up to:a b Saiki, R. ; Gelfand, D. ; Stoffel, S. ; Scharf, S. ; Higuchi, R. ; Horn, G. ; Mullis, K. ; Erlich, H. (1988). “Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase”. Science. 239 (4839): 487–491. doi:10.1126/science.2448875. PMID 2448875
  6. ↑ 6. ^ Jump up to:a b “Kary B. Mullis – Nobel Lecture: The Polymerase Chain Reaction”.
  7. ↑ 7. Jump up^ Cheng, S. ; Fockler, C. ; Barnes, W. M. ; Higuchi, R. (1994). “Effective Amplification of Long Targets from Cloned Inserts and Human Genomic DNA”. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (12): 5695–5699. doi:10.1073/pnas.91.12.5695. PMC 44063. PMID 8202550.
  8. ↑ 8. Jump up^ Carr AC, Moore SD (2012). Lucia, Alejandro, ed. “Robust quantification of polymerase chain reactions using global fitting”. PLoS ONE. 7 (5): e37640. doi:10.1371/journal.pone.0037640. PMC 3365123. PMID 22701526.
  9. ↑ 9. ^ Jump up to:a b Joseph Sambrook & David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-879-69576-5. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction
  10. ↑ 10. Jump up^ “Polymerase Chain Reaction (PCR)”. National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.
  11. ↑ “PCR”. Genetic Science Learning Center, University of Utah.
  12. ↑ 11. Jump up^ Pavlov, A. R. ; Pavlova, N. V. ; Kozyavkin, S. A. ; Slesarev, A. I. (2004). “Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications☆”. Trends in Biotechnology. 22 (5): 253–260. doi:10.1016/j.tibtech.2004.02.011. PMID 15109812.
  13. ↑ 12. Jump up^ Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (1990). “Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro”. Nucl Acids Res. 18 (21): 6409–6412. doi:10.1093/nar/18.21.6409. PMC 332522. PMID 2243783.
  14. ↑ 13. ^ Jump up to:a b Sharkey, D. J. ; Scalice, E. R. ; Christy, K. G. ; Atwood, S. M. ; Daiss, J. L. (1994). “Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerasehttps://upload.wikimedia.org/wikipedia/fa/4/4a/Button_numbers.png Chain Reaction”. Bio/Technology. 12 (5): 506–509. doi:10.1038/nbt0594-506.
  15. ↑ 14. ^ Jump up to:a b Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). “Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus”. J. Bacteriol. 127 (3): 1550–1557. PMC 232952. PMID 8432.
  16. ↑ 15. ^ Jump up to:a b Lawyer, F. ; Stoffel, S. ; Saiki, R. ; Chang, S. ; Landre, P. ; Abramson, R. ; Gelfand, D. (1993). “High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity”. PCR methods and applications. 2 (4): 275–287. doi:10.1101/gr.2.4.275. PMID 8324500.
اجزای لازم برای PCR استاندارد اجزای مخلوط واکنش تکنیک PCR | بیوتکنولوژی | زیست فناوری | زیست شناسی | انجمن بیوتکنولوژی | ستاد زیست فناوری | بیوتکنولوژی گیاهی | بیوتکنولوژی پزشکی | بیوتکنولوژی دارویی | بیوتکنولوژی میکروبی | زیست فن | آریوژن | سیناژن | آروکو | دکتر مهبودی | دکتر هاله حامدی فر | سعید کارگر | استخدامی بیوتکنولوژی | وضعیت شغلی بیوتکنولوژی | آینده بیوتکنولوژی |

تکنیک PCR | تکنیک PCR چیست | آموزش تکنیک PCR | انواع تکنیک PCR

چکیده تکنیک PCR

اختراع واکنش زنجیره ای پلیمراز نقطه عطفی در تاریخ علوم زیستی و پزشکی است. کاربرد PCR نه تنها به طور کامل در زمینه تحقیقات ژنتیک مولکولی به خصوص در بیوتکنولوژی جانوری و گیاهی انقلابی ایجاد کرده است بلکه این تکنیک، ارتباط و کارایی مبتکرانه خود را در زمینه های دیگر علم پزشکی قانونی، سیستماتیک مولکولی، اپیدمیولوژی مولکولی، باستان شناسی، مردم شناسی، ژنتیک تکاملی و غیره نیز ثابت کرده است. PCR سنتی منجر به ظهور RT-PCR، qPCR و ترکیب RT-PCR/qPCR شده است.

همچنین PCR قادر است با موفقیت “پروژه ژنوم انسان” را از طریق توانایی تکثیر و توالی یابی ژن های انسان، تکمیل کند که بیشتر پایه و اساس مهندسی ژنتیک شده است و حتی در حال حاضر ایجاد تغییرات مفید در ژنوم یک ارگانیسم را امکان پذیر ساخته است. واریانت های PCR در بسیاری از پیشرفت های اخیر که علوم دوره مدرن را ایجاد کرده اند به
طور موفقیت آمیزی مورد استفاده واقع شده است.

مقدمه تکنیک PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) سنگ بنا در زمینه ژنتیک مولکولی توسط Francis Crick و James D. Watson در سال ۱۹۵۳ با ارائه مدل ساختار دو رشته های DNA گذاشته شد. در اوایل ۱۹۶۰ ، توسط دکتر Gobind Khorana برنده جایزه نوبل در سال ۱۹۶۸ پیشرفت های قابل توجهی جهت روشن سازی کد ژنتیکی و سنتز اولیگونوکلئوتیدها که به عنوان الگوی پرایمری برای DNA پلیمراز استفاده می شوند، حاصل شد. Kjell Kleppe در سال ۱۹۷۱
پژوهشگر آزمایشگاه Khorana، همانند سازی قطعه ای از DNA را با استفاده از سیستم دو پرایمری توصیف کرد. واکنش زنجیره ای پلیمراز یک تکنیک آزمایشگاهی است که همانند سازی و تکثیر قطعه ای از DNA را به میلیون ها برابر آن امکان پذیر می سازد.

تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز توسط Kary Banks Mullis، در سال ۱۹۸۳ وقتی که وی به عنوان بیوتکنولوژیست در موسسه Emeryville، Cetus کالیفرنیای آمریکا کار می کرد، ابداع شد. در سال ۱۹۸۵ سرمایه به عنوان بیوتکنولوژیست در موسسه Perkin-Elmer و Cetus دیگر شرکت آمریکایی بیوتکنولوژی جهت طراحی ابزار چرخه حرارتی و معرف ها برای PCR صورت گرفت و در ۱۹۸۷ مطبوعات خبر دسترسی تجاری “PCR-1000 Thermal Cycler” و “DNA پلیمراز AmpliTaq” منتشر کردند، این اختراع، جایزه نوبل افتخارات خود را در شیمی و همچنین جایزه ژاپن را در سال ۱۹۹۳ از آن خود کرد.

Kary Banks Mullis کری مولیس | بیوتکنولوژی | زیست فناوری | زیست شناسی | انجمن بیوتکنولوژی | ستاد زیست فناوری | بیوتکنولوژی گیاهی | بیوتکنولوژی پزشکی | بیوتکنولوژی دارویی | بیوتکنولوژی میکروبی | زیست فن | آریوژن | سیناژن | آروکو | دکتر مهبودی | دکتر هاله حامدی فر | سعید کارگر | استخدامی بیوتکنولوژی | وضعیت شغلی بیوتکنولوژی | آینده بیوتکنولوژی |
Kary Banks Mullis کری مولیس

اجزای لازم برای PCR استاندارد

اجزای مخلوط واکنش تکنیک PCR
Taq/دیگر پلیمرازهای مقاوم به حرارت
DNA الگو
پرایمرها
داکسی نوکلئوتید تری فسفات ها (dNTPs)
MgCl2
پیپت خودکار/ظروف پلاستیکی/دستکش
دستگاه چرخه حرارتی (ترمال سایکلر)
Taq و دیگر پلیمرازهای مقاوم به حرارت

در سال ۱۹۶۹، Thomas D. Brock ترموفیلوس اکواتیکوس، گونه جدیدی از باکتری گرما دوست موجود در بخش زیرین چشمه آب گرم پارک ملی Yellowstone پلیمراز « جداسازی کرد. در سال ۱۹۷۶ آنزیم مقاوم به حرارت Taq از  Thermus aquaticus ایزوله شد در سال ۱۹۸۶، HenryErlich استفاده از پلیمراز Taq را در PCR خبر داد، چون این آنزیم می تواند فعالیت خود را در طیف وسیعی از درجه حرارت بالا حفظ کند اضافه کردن آن به مخلوط PCR کل روند PCR را بدون نیاز به اضافه کردن دستی DNA پلیمراز تازه از اشریشیاکلی در هر چرخه واکنش، کوتاه تر می کند زیرا DNA پلیمراز اشریشیاکلی قادر به تحمل گرمایش و سرمایش سریع نیست.

مسیر سنتیکی Taq پلیمراز در سنتز رشته الگو با واردکردن نوکلئوتیدی ها به وسیله Rothwell و Waksman در ۲۰۰۵ توصیف شده است. بسیاری از DNA پلیمرازهای مقاوم به حرارت نیز کشف شده اند که می توان برحسب کاربردشان از آن ها استفاده کرد (جدول ۱) معمولا از ۱-۱٫۵ DNA پلیمراز Taq در ۵۰μ از مخلوط واکنش مورد نیاز است. با این حال اگر مهارکننده ها (مثل درجه خلوص پایین DNA الگو) در مخلوط واکنش وجود داشته باشد، مقدار بالای DNA پلیمراز Taq (2-3U) جهت حصول بازده بهتر محصولات تکثیرشده، لازم است.

DNA الگو :

معمولا از ۰٫۱ – ۱ نانوگرم DNA الگو برای DNA پلاسمید یا فاژ و ۰٫۱ – ۱ میکرگرم برای DNA ژنومی در ۵۰μl مخلوط تام واکنش مورد نیاز است. DNA الگوی بیشتر از این مقدار سبب تولید فرآورده های غیر اختصاصی PCR می شود؛ بنابراین باید DNA خالص باشد به طوری که، حتی وجود مقدار خیلی جزئی از فنول،EDTA، پروتئیناز K و غیره مورد استفاده در جداسازی DNA شدیدا فعالیت DNA پلیمراز Taq می کند. با این حال رسوب DNA با اتانول و شستشوی پلیت DNA با اتانول ۷۰ % معمولا در حذف این آلودگی ها از نمونه DNA مؤثر هستند.

پرایمرها :

موضوع بسیار مهم برای تکثیر جایگا ه های هدف در داخل یک ناحیه ای از ژنوم، طراحی پرایمر است. پرایمر موفق عمدتا برای دستیابی به دو هدف یعنی ویژگی و کارایی طراحی می شود. در صورتی که پرایمرها جهت پیشگیری از نتایج مثبت کاذب، با دقت کافی طراحی شوند هردوی این اهداف دست یافتنی می باشند. در زیر ملاحظاتی که هنگام طراحی پرایمر باید در ذهن داشته باشیم آورده شده است.

طول پرایمر در PCR :

طول یک پرایمر به طور مستقیم با ویژگی واکنش PCR متناسب است. همچنین طول پرایمر، دمایی را مشخص می کند که در آن پرایمر به DNA الگو متصل خواهد شد. معمولا پرایمرها در طولی بین ۱۸ تا ۲۴ باز طراحی می شوند اگر چه حداقل طول پرایمر به وسیله اندازه ژنوم تعیین می شود. یک

محتوای GC پرایمر در PCR :

محتوای GC مهم است زیرا مقدار Tm یک توالی را تعیین می کند. اولیگونوکلئوتیدی با طول ۲۰ جفت بازی و حاوی ۵۰% CG معمولا مقدار Tm بین ۵۶ – ۶۲ درجه سانتیگراد دارد. محتوای GC بسیار مطلوب باید بین ۴۰ تا ۶۰ درجه Tm سانتیگراد داشته باشد. از وجود بیش از سه نوکلئوتید C یا G در انتهای ‘ ۳ پرایمر باید اجتناب شود زیرا ممکن است منجربه پرایمینگ غیر اختصاصی (اتصال غیراختصاصی پرایمر) شود.

دمای ذوب (Tm) پرایمرها :

ازآنجا که در یک واکنش PCR مجموعه ای از پرایمرها استفاده می شوند از این رو باید سعی شود تا جفت پرایمری هایی انتخاب شوند که Tm آن ها از همدیگر بیش از ۵ درجه سانتیگراد اختلاف نداشته باشند، بنابراین محتوای GC و طول پرایمر باید بر این اساس انتخاب شوند. معمولا Tm در دامنه ۶۲ – ۷۰ درجه سانتیگراد قرار دارد.

برآورد دمای ذوب و دمای آنلینگ پرایمر:

برای پرایمرهای کمتر از ۲۵ نوکلئوتید، تقریبا Tm با استفاده از فرمول زیرین  محاسبه م ی شود: که در  G، C، A، T
تعداد نوکلئوتیدهای مربوطه در پرایمر هست:
(Tm = 4(G+C) + 2(A+T

وارد کردن جایگاه محدود کننده در پرایمرها :

۳-۶ نوکلئوتید به انتهای ‘۵ پرایمر اضافه می شود بنابراین به طور موفقیت آمیزی جایگاهی برای برش محدود کننده در توالی های تکثیر شده، فراهم می کند.

مکمل بودن پرایمر :

پرایمر نباید مکمل خود یا مکمل دیگر پرایمرهای موجود در مخلوط واکنش باشد، از این رو از وجود همولوژی داخل و بین پرایمرها باید پرهیز شود زیرا می تواند منجر به ایجاد دیمر پرایمر شود.

تکرار بازها :

از تکرار باز منفرد یا دو باز برای ۴ مرتبه یا بیشتر باید پرهیز شود.

نوکلئوتید انتهایی در پرایمر PCR : 

موقعیت انتهایی در پرایمر جهت حذف جفت شدن ناجور ضروری است. برای پرهیز از آن، از پرایمرهایی که در انتهاهای ‘ ۳ خود مکمل
هستند، اجتناب شود زیرا این امر ممکن است سبب تشکیل غیرضروری دیمر پرایمر شود.

ساختارهای ثانویه :

از ایجاد ساختارهای ثانویه حتی المقدور باید پرهیز شود، ساختارهای ثانویه در نتیجه واکنش های بین مولکولی یا درون مولکولی به وجود می آیند. سنجاق سرها، دیمرهای خودی، دیمرهای متقابل، همه در نتیجه ساختارهای ثانویه حاصل می شوند.

dNTPs :

غلظت هر dNTP در مخلوط نهایی واکنش معمولا ۲۰۰μM است و غلظت هر (dNTPs ,dATP, dCTP, dGTP, dTTP) باید یکسان باشد. غلظت نادرست حتی یک dNTP منفرد ممکن است سبب افزایش درج اشتباه نوکلئوتیدها در رشته جدید شود.

MgCl2 :

در طی همانند سازی یک جفت الکترون منفرد در ناحیه OH-‘3 زنجیر در حال تکثیر ظاهر می شود که برای تشکیل پیوند فسفودی استر توسط پلیمراز Taq استفاده می شود. این جفت الکترون منفرد جهت تبدیل dNTP به dNMP از طریق حمله نوکلئوفیلی بر روی اتم فسفات گروه α-فسفات استفاده شده و پیروفسفات (γ و β) آزاد می گردد؛ اما dNTP ورودی چهار بار منفی دارد و به علت وجود این بارهای منفی، از حمله نوکلئوفیلی جلوگیری به عمل می آید، بنابراین، +Mgبا کلاته کردن بارهای منفی اضافی نوکلئوتید ورودی، حمله نوکلئوفیلی (هسته دوستی) و تشکیل پیوند و در نتیجه پلیمریزاسیون را تسهیل می کند.

همچنین همه آنزیم ها برای فعالیتشان نیاز به کوفاکتور دارند و یون فلزی  +Mgبه عنوان کوفاکتور ضروری برای DNA پلیمراز در  PCR عمل می کند. یون +Mgجهت اتصال و ایجاد نیرو، وارد پروتئین شده و پلیمراز را قوی تر کرده تا بتواند به  dNTP متصل شود اما به صورت اختصاصی این کار را انجام می دهد؛ بنابراین افزایش غلظت +Mgدر PCR سبب پیوند قوی می شود اما احتمال تکثیر غیر اختصاصی نیز افزایش می یابد. بدین خاطر غلظت آن باید برای هر سیستم پرایمر الگو بهینه شود.

همچنین اجزای دیگر واکنش PCR شامل پرایمرهای، الگو، محصولات PCR و dNTPs به یون +Mgمتصل می شوند. غیر از این ها dNTPs تمایل زیادی برای اتصال به یون +Mgدارند و به خاطر همین یون +Mgآزاد لازم است تا به عنوان کوفاکتور آنزیم در PCR عمل کند بنابراین غلظت تام یون +Mgباید بیشتر از غلظت تام dNTP باشد. دامنه غلظت توصیه شده برای MgCl2 در مخلوط استاندارد واکنش ۱ تا ۴mM است.

اجزای لازم برای PCR استاندارد اجزای مخلوط واکنش تکنیک PCR | بیوتکنولوژی | زیست فناوری | زیست شناسی | انجمن بیوتکنولوژی | ستاد زیست فناوری | بیوتکنولوژی گیاهی | بیوتکنولوژی پزشکی | بیوتکنولوژی دارویی | بیوتکنولوژی میکروبی | زیست فن | آریوژن | سیناژن | آروکو | دکتر مهبودی | دکتر هاله حامدی فر | سعید کارگر | استخدامی بیوتکنولوژی | وضعیت شغلی بیوتکنولوژی | آینده بیوتکنولوژی |
اجزای لازم برای PCR استاندارد اجزای مخلوط واکنش تکنیک PCR

پیپت های خودکار، ظروف پلاستیکی و دستکش :

پیپت های خودکار (۱ -۱۰μl, 10-100μl & 100-1000μl)، لوله های میکروسانتریفویوژی ، سرسمپلرها، محل PCR و غیره در طول PCR و برای بارگذاری محصولات تکثیر یافته در ژل آگارز لازم هستند.

ترمال سایکلر (سایکلر حرارتی) :

ابزاری است که دما را در طول هر چرخه برای دناتوراسیون، آنلینگ، بسط و روند نگهداری بسیار سریع تغییر می دهد.

اصول، روش و آشکارسازی پس از تکثیر PCR

اصول PCR بر پایه این واقعیت استوار است که در دمای دناتوراسیون بالا نزدیک ۹۵ درجه سانتیگراد، دو رشته مولکول DNA هدف به علت شکستن پیوندهای G-C و A-T از هم جدا می شوند. در دمای های آنلینگ در دامنه ۵۰ تا ۶۰ درجه سانتیگراد پرایمرهای مکمل جلو (Forward) و معکوس (Reverse) به انتهای ‘ ۳ اتصال یافته و مولکول DNA هدف تک رشت های را از دو طرف محصور می کنند.

سپس پلیمراز Taq رشته جدید DNA را با اضافه کردن dNTP ها توسعه داده و مولکول دو رشته ای خودش را در دمای توسعه ۷۲ درجه سانتیگراد بازسازی می کند. این روند چند بار تکرار شده و چندین نسخه از مولکول DNA هدف را به وجود می آورد (شکل زیر). برای نتایج بهتر، دستوالعمل های عملی شبکه کیفی ژنتیک مولکولی اورپا (EMQN) باید مورد مطالعه قرار گیرد.

روش انجام کار :

ابتدا دناتوراسیون در دمای ۹۰ تا ۹۵ درجه سانتیگراد به مدت DNA 3-5 دقیقه صورت می گیرد و طی آن دو رشته مولکول دو رشته ای هدف از هم جدا می شوند. دناتوراسیون اولیه توسط ۳۰ تا ۳۵  چرخه دناتوراسیون، آنلینگ و توسعه دنبال می شود. تعداد چرخه PCR بستگی به مقدار DNA الگو در مخلوط واکنش و بازده مورد انتظار محصول PCR دارد.

دناتوراسیون شامل حرارت دادن مولکول دو رشته ای DNA هدف در دمای ۹۰ تا ۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ تا ۳۵ ثانیه است. مرحله آنلینگ اجازه اتصال پرایمرهای مکمل Forward و Reverse به ناحیه طرفین DNA الگو را در دمای ۵۰ تا ۶۵ درجه سانتیگراد در مدت ۳۰ تا ۵۵ ثانیه می دهد.

مرحله بسط پرایمر در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰-۵۵ ثانیه رخ می دهد و طی آن dNTP های مکمل به رشته های جدید اضافه می شوند. پس از چرخه نهایی، معمولا نمونه ها در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۵ تا ۱۵ دقیقه جهت پر کردن انتهاهای بیرون زده محصولات PCR جدیدا سنتز شده، انکوبه می شوند. ذخیره و نگهداری محصولات PCR در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت زمان نامحدود می تواند صورت بگیرد.

آشکارسازی پس از تکثیر

پس از الکتروفورز محصول PCR توسط ژل آگارز، ژل آگارز با محلول اتیدیوم بروماید (EtBr) رنگ آمیزی می شود و سپس در زیر تابش نور UV محصول PCR در ژل به صورت رنگ صورتی مشاهده می شود. اتیدیم بروماید سال های زیادی برای رویت اسیدهای نوکلئیک در ژل آگارز استفاده شده است. البته اتیدیم بروماید جهش زای بالقوه بوده و سبب جهش در سلولهای زنده می شود؛ بنابراین ژل باید در یک ظرف زباله اختصاصی گذاشته شود که با علامت خطر نشان دار شده و تاریخ گذاری شده و به بخش زیست محیطی و ایمنی تحویل داده شود.

کلنی PCR


نقشه برداری سه بعدی ژنوم انسان | ژنوم لامین‌های هسته‌ای | مارکرها | جابجایی کروموزوم‌ها | نقشه برداری سه بعدی هسته سلول | Illinois| لامین‌های هسته‌ای| tyramide signal amplification sequencing

نقشه برداری سه بعدی ژنوم انسان

نقشه برداری سه بعدی ژنوم انسان

با گذشت بیش از 20 سال از توالی یابی ژنوم انسان، هنوز زوایای پنهان بسیار زیادی در خصوص نحوه بسته بندی ژنوم در هسته سلول‌ها وجود دارد که روشن نشده است. به تازگی محققان دانشگاه Illinois ایالات متحده آمریکا موفق به ابداع روشی شده‌اند که به وسیله آن موقعیت دقیق مکانی هر ژن درون هسته را مشخص کرده و از این طریق نقشه سه بعدی آن را ارائه می‌دهند.

در این روش که tyramide signal amplification sequencing یا TSA-Seq نام دارد ابتدا اقدام به هدف گیری اجزای خاصی از هسته مانند لامین‌های هسته‌ای، به وسیله آنزیم horseradish peroxidase می‌کنند.

آنزیم اتصال یافته به این مارکرها سپس تولید ماده واکنش پذیر تیرامید می‌نماید که توانایی نشانه گذاری توالی های DNA نزدیک به خود را دارد و میزان شدت علامت گذاری با فاصله آن توالی از آنزیم نسبت معکوس خواهد داشت، از این طریق موقعیت فضایی همه ژن‌ها را به صورت هم زمان نسبت به مارکرهای خاص موجود در هسته تعیین می‌کنند.

محققان امیدوارند به وسیله نقشه برداری سه بعدی هسته سلول بتوانند به نقش جابجایی کروموزوم‌ها در بیان ژن‌ها و همچنین تاثیر این حرکات در بوجود آمدن انواع بیماری‌ها پی ببرند.

کانال بیوتکنولوژی وان

سایت مهندسی علوم زیستی

نقشه برداری سه بعدی ژنوم انسان | ژنوم لامین‌های هسته‌ای | مارکرها | جابجایی کروموزوم‌ها | نقشه برداری سه بعدی هسته سلول | Illinois| لامین‌های هسته‌ای| tyramide signal amplification sequencing

نقشه برداری سه بعدی ژنوم انسان | ژنوم لامین‌های هسته‌ای | مارکرها | جابجایی کروموزوم‌ها | نقشه برداری سه بعدی هسته سلول | Illinois| لامین‌های هسته‌ای| tyramide signal amplification sequencing

ابداع نسلی جدید از روش‌های طبقه بندی سلولی | فلوسایتومتری | طبقه بندی سلول‌ها | Image-Activated Cell Sorting | میکروفلوئیدیک | اپتیک | سرفصل های سمپوزیوم فلوسایتومتری | کاربردهای فلوسایتومتری | فلوسایتومتری pdf | فلوسایتومتری ppt |پروتکل فلوسایتومتری | تفسیر نتایج فلوسایتومتری | تفسیر نمودار فلوسایتومتری | قیمت دستگاه فلوسایتومتری | پاورپوینت فلوسایتومتری | Flow Cytometry Symposium

 ابداع نسلی جدید از روش‌های طبقه بندی سلول

 ابداع نسلی جدید از روش‌های طبقه بندی سلول

بالغ بر پنجاه سال است که فلوسایتومتری به عنوان روشی کارآمد در طبقه بندی سلول‌ها بر اساس پروفایل مارکرهای بیانی سطح سلول‌، مورد استفاده قرار می‌گیرد اما اخیرا در یک همکاری گسترده بین‌المللی محققان موفق به ابداع نسل جدید روش‌های طبقه بندی به نام Image-Activated Cell Sorting,” IACS شده‌اند که احتمالا موجب تحول عظیمی در حوزه علوم زیستی خواهد شد.

این روش یک مکانیسم کاملا هوشمند است که حاصل تلفیق بخش‌های مختلف علمی نظیر اپتیک، میکروفلوئیدیک، ریاضیات و علوم مهندسی است و در نهایت موجب دسته بندی و جداسازی دقیق سلول‌ها خواهد شد با این تفاوت که در این روش علاوه بر ویژگی‌های فنوتیپی سطح سلول، با در نظر گرفتن مورفولوژی ، شکل فضایی و پروفایل بیانی داخل سلول طبقه بندی جامعتر و دقیقتری از نمونه‌ها ارائه خواهد داد.

هدف از توسعه این روش ارائه تصویر دوبعدی از سلول‌ها برای بررسی شکل فضایی آنها و در نهایت واکاوی ارتباط بین شکل سلول و وظایف آن بوده است. با استفاده از این روش ، محققان می‌توانند فرایند جداسازی، تصویر برداری و پردازش داده های با کیفت بالا را در عرض 32 میلی ثانیه به انجام برسانند و از این طریق به سطوح بالای دقت و سرعت برسند، امری که امروزه شاید نیازمندی اصلی تحقیقات علوم زیستی باشد.

کانال بیوتکنولوژی وان

سایت مهندسی علوم زیستی

لینک مقاله 

ابداع نسلی جدید از روش‌های طبقه بندی سلولی | فلوسایتومتری | طبقه بندی سلول‌ها | Image-Activated Cell Sorting | میکروفلوئیدیک | اپتیک | سرفصل های سمپوزیوم فلوسایتومتری | کاربردهای فلوسایتومتری | فلوسایتومتری pdf | فلوسایتومتری ppt |پروتکل فلوسایتومتری | تفسیر نتایج فلوسایتومتری | تفسیر نمودار فلوسایتومتری | قیمت دستگاه فلوسایتومتری | پاورپوینت فلوسایتومتری | Flow Cytometry Symposium
ابداع نسلی جدید از روش‌های طبقه بندی سلولی | فلوسایتومتری | طبقه بندی سلول‌ها | Image-Activated Cell Sorting | میکروفلوئیدیک | اپتیک | سرفصل های سمپوزیوم فلوسایتومتری | کاربردهای فلوسایتومتری | فلوسایتومتری pdf | فلوسایتومتری ppt |پروتکل فلوسایتومتری | تفسیر نتایج فلوسایتومتری | تفسیر نمودار فلوسایتومتری | قیمت دستگاه فلوسایتومتری | پاورپوینت فلوسایتومتری | Flow Cytometry Symposium

Highlights
•Demonstration of deep-learning-assisted image-activated cell sorting
•Demonstration of the technology’s utility to various types and sizes of cells
•Image-activated sorting of microalgal cells based on protein localization
•Image-activated sorting of blood cells based on cell-cell interaction

تصویر مربوط به رشد آکسون های نخاعی | سلول سرطانی در حال متاستاز | حرکت جمعی سلول ها | اندوسیتوزیس | تصویر مربوط به جابه جایی میکروتوبولی | مهاجرت سلول های ایمنی New microscope captures detailed 3-D movies of cells deep within living systems

فیلم و عکس سه بعدی از سلول های زنده

فیلم سه بعدی از سلول های سیستم ایمنی توسط میکروسکوپ 10فوتی

اریک بتزیک فیزیکدان برجسته هاروارد (Howard Hughes Medical Institute ) و گروهی از همکارانش برای نخستین بار میکروسکوپی منحصر به فرد و غول پیکر را برای بررسی سلول های سیستم ایمنی طراحی نمودند. این فیزیکدان برجسته و تیم همراهش برای نخستین بار دو تکنولوژی پیشرفته میکروسکوپی را با یکدیگر ادغام کردند تا بتوانند ویدئوی سه بعدی (3-D video ) از حرکت سلول های سیستم ایمنی در بدن یک موجود زنده تهیه کنند.

این محققین نتایج حاصل از پژوهش جالب خود را 19 آپریل در مجله ساینس منتشر کردند.آنهابرای ساخت میکروسکوپ منحصر به فرد خود adaptive optics (که اخترشناسان برای به دست آوردن تصاویر واضح از اجسام آسمانی موجود در جو زمین استفاده می کنند ) را با نوع خاص از میکروسکوپ نوری ( lattice light sheet microscopy ) ادغام کردند و با موفقیت تصاویر سه بعدی از حرکت سلول های ایمنی در بدن یک موجود زنده تهیه کردند.

میکروسکوپی که آن ها ساختند 10 فوت (3.048 متر ) طول دارد! بتزیک و همکارانش تلاش برای ساخت دومین نسل این نوع از میکروسکوپ را با هدف رسیدن به ابعادی کوچک تر برای آن آغاز کرده اند.

در این پژوهش پیوند علم فیزیک با علم ایمونولوژی در بالاترین سطح خود منجر به نتیجه ای شده است که احتمالا تحول بنیادی را در دانش و درک فعلی ما از نحوه ی عملکرد و حرکت سلول های ایمنی ایجاد خواهد کرد.با تلاش های این محققین به زودی باید شاهد فیلم های سه بعدی با وضوح بالا از سلول های سیستم ایمنی در بدن موجودات زنده باشیم..البته به امید نیاز به یک میکروسکوپ با اندازه معمول نه نوعی هیولا( بتزیک به طنز ساخته خود را نوعی هیولا دانسته)

📝منبع : The scientist/staff April 23. 2018

رفرنس مقاله در ساینس:
T. Liu et al., “Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms,” Science, doi:10.1126/science.aaq1392, 2018.

فیلم سه بعدی تهیه شده ار حرکت سلول های ایمنی در گوش درونی نوع خاصی از ماهی

 

نمونه ای از تصاویر تهیه شده با این تکنولوژی جدید (AO-LLSM ) را در تصویر مشاهده می فرمایید. در جهت گردش عقربه های ساعت شروع از بالا سمت چپ تصاویر به ترتیب مربوط هستند به :

تصویر مربوط به رشد آکسون های نخاعی

سلول سرطانی در حال متاستاز

حرکت جمعی سلول ها

اندوسیتوزیس

تصویر مربوط به جابه جایی میکروتوبولی

مهاجرت سلول های ایمنی

🎯تصویر مرکزی :
🔍تصویری از دینامیک ارگانل های سلولی


تصویر مربوط به رشد آکسون های نخاعی | سلول سرطانی در حال متاستاز | حرکت جمعی سلول ها | اندوسیتوزیس | تصویر مربوط به جابه جایی میکروتوبولی | مهاجرت سلول های ایمنی New microscope captures detailed 3-D movies of cells deep within living systems

تصویر مربوط به رشد آکسون های نخاعی | سلول سرطانی در حال متاستاز | حرکت جمعی سلول ها | اندوسیتوزیس | تصویر مربوط به جابه جایی میکروتوبولی | مهاجرت سلول های ایمنی
New microscope captures detailed 3-D movies of cells deep within living systems

کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز - Hydrophobic interaction chromatography - HIC

کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز – Hydrophobic interaction chromatography – HIC

کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز

کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز (HIC) :

در این روش پروتئین ها براساس تفاوت در میزان هیدروفوبیسته سطحشان از یکدیگر جدا می شوند، بدین صورت که میانکنش برگشت پذیر بین نواحی غیرقطبی در سطح پروتئین و لیگاندهای هیدروفوب تثبیت شده بر روی ہستر ستون کروماتوگرافی شکل می گیرد. پروتئین ها براساس تفاوت در میزان اسیدآمینه های هیدروفوب سطحی شان از یکدیگر تفکیک می شوند. این روش می تواند در فرآیندهای تخلیص چند مرحله ای به عنوان یکی از روش های میانی بکار گرفته شود.

عوامل موثر بر میانکنش هیدروفوب و لیگاند هیدروفوب در HIC :

میانکنش بین پروتئین های هیدروفوب و لیگاندهای هیدروفوب تحت تاثیر چند پارامتر است:

۱- نوع لیگاند

نوع لیگاند تثبیت شده (مثلا آلکیل یا آریل) تعیین کننده ویژگی جذب پروتئین می باشد. بطور کلی لیگاندهای آلکیل هیدروفوبیسیته بیشتری نسبت به آریل ها دارند. هرچقدر میزان لیگاندهای هیدروفوب تثبیت شده بیشتر باشد ظرفیت اتصال به پروتئین ستون نیز افزایش مییابد (شکلی زیر تعدادی از لیگاندهای هیدروفوب را نشان میدهد.)

معمول ترین رزین ها با گروه های هیدروفوب لینک شده به آگارز که در کروماتوگرافی HIC استفاده می شود.

معمول ترین رزین ها با گروه های هیدروفوب لینک شده به آگارز که در کروماتوگرافی HIC استفاده می شود.

معمول ترین رزین ها با گروه های هیدروفوب لینک شده به آگارز که در کروماتوگرافی HIC استفاده می شود.

معمول ترین رزین ها با گروه های هیدروفوب لینک شده به آگارز که در کروماتوگرافی HIC استفاده می شود.

۲- نوع ماتریکس

ماتریکس یا بستر ستون باید خنثی و البته هیدروفیل باشد تا میانکنش های یونی بین پروتئین و ماتریکس وجود نداشته باشد. دو بستر هیدروفیل مناسب که بسیار استفاده می شوند، آگارز کراس لینک شده یا کوپلیمرهای سنتتیک می باشند.

۳- نوع و غلظت نمک

یک غلظت نمکی بالا میانکنش را افزایش می دهد در حالیکه پائین آوردن غلظت نمکی میانکنش هیدروفوب را تضعیف می کند. باید به نوع نمک نیز توجه نمود بطوریکه نمک های کائوتروپ مثل سولفات یا کلراید منیزیم در آن اصلاً مناسب نیستند و میانکنش های هیدروفوب را تضعیف می کنند. برعکس سدیم، پتاسیم یا آمونیوم سولفات میانکنش های هیدروفوب را تقویت می کنند.


مقالات مرتبط :

ویدیو کروماتوگرافی تعویض یونی (IEC)

ویدیو کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز (HIC)


pH -4

زمانیکه pH نزدیک pI است بار پروتئین نزدیک به صفر است و میانکنش های هیدروفوب بدلیل کاهش دافع های الکتروتستاتیک بین مولکول های پروتئین حداکثر است. بطور کلی افزایش pH در بسیاری از مورد با تضعیف میانکنش های هیدروفوب همراه است. البته لازم به ذکر است که اثر pH در کروماتوگرافی HIC کمی پیچیده است.

 ۵- حرارت

نقش حرارت در این کروماتوگرافی پیچیده است اما بطور کلی بالا بردن حرارت درگیری پروتئین با ستون را افزایش می دهد.

6- افزودنی ها

الکل ها، دترجنت ها و نمک های کائوتروپ میانکنش های لیگاند- پروتئین را در HIC تضعیف می کنند و باعث جدا شدن ترکیبات متصل شده از ستون می شوند، لذا هنگام استفاده از افزودنی ها باید دقت کافی بکار برد.

نتیجه گیری :

بنابراین پروتئین های متصل شده به رزین میتوانند با کاهش غلظت نمک، بالا بردن pH یا افزودن الکل ها و دترجنت ها از ستون جدا و شسته شوند.

[fvplayer src=”https://biotecher.ir/wp-content/uploads/2017/12/HIC-Chromatography-1.mp4″ width=”640″ height=”360″]

نویسنده : سعید کارگر

کانال تلگرامی بیوتکنولوژی

 

کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز

کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز

 

انواع كروماتوگرافی – کروماتوگرافی تعویض یونی (IEC)

کروماتوگرافی تعویض یونی

کروماتوگرافی

کروماتوگرافی به يک سری تکنیک های جداسازی گویند که در آنها مولکول ها میان دو فاز (فاز ثابت و فازمتحرک) از یکدیگر جدا می شوند. مولکول هایی که تمایل بالایی به فاز ثابت دارند، نسبت به آنهایی که به فاز متحرک تمایل نشان میدهند با سرعت کمتری حرکت می کنند. فاز ثابت در کروماتوگرافی بستر خلل و فرج داری است که درون ستون قرار گرفته و فاز متحرک محلول شستشو است که از بالای ستون به درون آن پمپ می شود. براساس اینکه فاز متحرک مایع یا گاز باشد انواع کروماتوگرافی های مایع و گازی وجود خواهد داشت. 

کروماتوگرافی تعویض یونی (IEC)

این روش براساس تفاوت بار سطحی در پروتئین ها آن ها را از یکدیگر جدا می کند. تخلیص بر پایه یک میانکنش برگشت پذیر بین یک پروتئین باردار و یک بستر یا لیگاند با بار مخالف (برهمکنش های یونی) است.

کروماتوگرافی تعویض یونی براساس تفاوت بار سطحی در پروتئین ها آن ها را از یکدیگر جدا می کند. تخلیص بر پایه یک میانکنش برگشت پذیر بین یک پروتئین باردار و یک بستر یا لیگاند با بار مخالف (برهمکنش های یونی) است.

کروماتوگرافی تعویض یونی براساس تفاوت بار سطحی در پروتئین ها آن ها را از یکدیگر جدا می کند. تخلیص بر پایه یک میانکنش برگشت پذیر بین یک پروتئین باردار و یک بستر یا لیگاند با بار مخالف (برهمکنش های یونی) است.

در این روش پروتئین هایی که خالص می شوند رقیق نمی شوند (برعکس روش ژل فیلتراسیون). تعویض کننده های یونی بسترهایی هستند که در آنها گروه های اسیدی و یا قلیایی متعددی وجود دارد. تعویض کننده های یونی قلیایی شامل گروه های با بار مثبت اند که تعویض کننده آنیونی نامیده میشوند. تعویض کننده های کاتیونی حامل گروه های با بار منفی اند که گروه های با بار مثبت را جذب می کنند .

انتحاب رزین تعویض کننده یونی - کرماتوگرافی تعویض یونی

انتحاب رزین تعویض کننده یونی

بار سطحی پروتئین ها به pH محیط بستگی دارد. زمانیکه pH بالاتر از نقطه ایزوالکتریک پروتئین (pl) است، پروتئین هدف بار منفی دارد و قادر به اتصال به یک لیگاند با بار مثبت (تعویض کننده آنیونی با بار مثبت) می باشد. زمانیکه pH پائین تر از نقطه ایزوالکتریک باشد پروتئین هدف بار مثبت پیدا می کند و  قادر به اتصال به یک تعویض کننده کاتیونی با بار منفی خواهد بود.

 

ار سطحی پروتئین ها به pH محیط بستگی دارد. زمانیکه pH بالاتر از نقطه ایزوالکتریک پروتئین (pl) است، پروتئین هدف بار منفی دارد و قادر به اتصال به یک لیگاند با بار مثبت (تعویض کننده آنیونی با بار مثبت) می باشد.

ار سطحی پروتئین ها به pH محیط بستگی دارد. زمانیکه pH بالاتر از نقطه ایزوالکتریک پروتئین (pl) است، پروتئین هدف بار منفی دارد و قادر به اتصال به یک لیگاند با بار مثبت (تعویض کننده آنیونی با بار مثبت) می باشد.

کروماتوگرافی تعویض کاتیونی و آنیونی :

شایان ذکر است که هرچه pH محلول فاصله بیشتری از pl پروتئین داشته باشد اتصال پروتئین به بستر محکم تر صورت می گیرد. به دلیل اینکه اتصالات الکتروستاتیک در قدرت یونی پائین انجام می شوند لذا اولین مرحله (یعنی اتصال) در این روش در قدرت های یونی پائین صورت خواهد گرفت، سپس شرایط تغییر کرده و ترکیبات متصل شده با افزایش قدرت يونی- افزایش غلظت نمک یا تغییر pH – که بصورت گرادیان یا مرحله به مرحله اعمال می شود از ستون شسته و جدا می شوند. در این روش معمولا پروتئین هدف به ستون متصل می شود امادر صورت لزوم میتوان ناخالصی ها را هم به متون متصل کرد و پروتئین هدف را در همان مرحله اول جداسازی کرد. شایان ذکر است که این روش معمولاً جزء روش های میانی در پروسه تخلیص پروتئین می باشد. 

 

بافرهای رایج برای کروماتوگرافی تعویض کاتیونی و آنیونی

بافرهای رایج برای کروماتوگرافی تعویض کاتیونی و آنیونی

[fvplayer src=”https://biotecher.ir/wp-content/uploads/2017/12/The-Principle-of-Ion-Exchange-Chromatography.mp4″]

 

نویسنده : سعید کارگر

کانال تلگرامی بیوتکنولوژی

 

روش TA کلونینگ - مزیت ها و معایب روش TA کلونینگ

روش TA کلونینگ – مزیت ها و معایب روش TA کلونینگ

روش TA کلونینگ :

TA  کلونینگ یک روش ساب کلونینگ است که در آن از آنزیم های محدوالاثر استفاده نمی شود و نسبت به روش معمول کلونینگ سریعتر و ساده تر است. این روش مبتنی بر توانایی بازهای A و T در قطعات مختلف DNA برای هیبرید شدن با یکدیگر است. در این روش قطعه ژنی با استفاده از آنزیم Taq DNA پلیمراز و PCR تکثیر و تولید می شود. این پلیمراز فعالیت تصحیح ‘۳ به ‘۵ ای ندارد و به احتمال زیاد یک ‘۳- آدنین آویزان انتهایی را در هر دو انتهای محصول PCR ایجاد می کند.

آنزیم ترمینال ترانسفراز

در این روش بهتر است که پرایمرهای PCR در انتهای ۵ گوانین داشته باشند زیرا در این حالت Taq پلیمراز با احتمال بیشتری A را در انتهای ۳ قرار می دهد. و کتور هدف نیز با استفاده از آنزیم های محدوالاثر که انتهاهای صاف ایجاد می کنند خطی و سپس به کمک آنزیم ترمینال ترانسفراز به آنها ddTTP اضافه می شود. افزودن وکتور و قطعه مورد نظر در حضور لیگاز باعث جفت شدن A و T های انتهای می شود، شایان ذکر است که امروزه TAکلونینگ وکتورهای تجاری که وکتورهای خطی شده با یک T آویزان انتهایی هستند توسط کمپانی های مختلف تهیه و در دسترس هستند.

مزیت روش TA کلونینگ :

از مزیت های این روش این است که نیازی به اضافه کردن آنزیم های برشی (به غیر از مرحله خطی کردن و کتور) و تهیه پرایمرهای طویل دارای مکان های شناسایی آنزیمهای محدودالاثر نیست.

ایراد روش TA کلونینگ :

اما یکی از معایب این روش این است که جهت قطعه ای که کلون می شود مشخص نیست یعنی ژن هدف ۵۰٪ با جهت معکوس کلون خواهد شد۔

 

نویسنده : سعید کارگر

کانال تلگرامی بیوتکنولوژی

 

چهار نوع عمده کشت سلول ، ٬ انجمن بیوتکنولوژی ٬ بیوتکنولوژی ٬ ارشد بیوتکنولوژی ٬ دکترای بیوتکنولوژی ٬ بازار کار بیوتکنولوژی ٬ بیوتکنولوژی حیوانات ٬ بیوتکنولوژی دارویی ٬ رتبه لازم برای بیوتکنولوژی ٬ بیوتکنولوژی دانشگاه تهران ٬ بیوتکنولوژی مهندسی شیمی ٬ بیوتکنولوژی میکروبی ٬ بیوتکنولوژی پزشکی ٬ بیوتکنولوژی چیست ٬ بیوتکنولوژی گیاهی٬ زیست فناوری ٬ زیست فن آوری ٬ مهندسی علوم زیستی ٬ دانشگاه تهران ٬ کارنامه ارشد بیوتکنولوژی پزشکی ٬ کریسپر ٬ متاژنومیکس ٬ بیومارکر ٬ تراریخته ٬ ترانس ژنیک ٬ ترانسژنیک٬ اینستاگرام بیوتکنولوژی٬ کانال تلگرامی بیوتکنولوژی٬ گروه تلگرامی بیوتکنولوژی ٬ کانال بیوتکنولوژی دانشگاه تهران ٬ فلورسنس ٬ فلوسایتومتری ٬ مهندسی ژنتیک ٬ میکروارگانیسم ٬ میکروبیوم ٬ پیگمنت ٬ ژن درمانی ٬ ژن گزارشگر ٬ فلورسنت ٬ باکتری٬ آنتی بادی منوکلونال ٬ آلزایمر٬ سرطان ٬ ترانسژنیک ٬ ابریشم ٬ پروموتور ٬ حشرات سایبورگ ٬ بیونیک سنتتیک بیولوژی ٬ CRISPR، crispr چیست؟، pre-crRNA، spacer، تکنیک کریسپر، روش crispr، ساختار ژنی کریسپر، سیستم CRISPR/Cas، سیستم ویرایش ژنومی کریسپر/Cas، فناوری کریسپر، کریسپر، کریسپر pdf، کریسپر چیست؟، کریسپر+ppt، کمپلکس Cas، مکانیسم کریسپر، نقش سیستم کریسپر/Casدر باکتری ٬ بیوتکنولوژی دانش آموزی

چهار نوع عمده ی کشت سلول

چهار نوع عمده ی کشت سلول

کشت سلول 

کشت عضو (organ cultur) :

بافت از یک طرف در محیط کشت غوطه ور است و از طرفی به طور مستقیم تبادل گاز انجام می دهد. این وضعیت باعث حفظ خصوصیات بافتی عضو مورد نظر می شود. این روش به دلیل مشکلاتی نظیر عدم اکسیژن رسانی و تغذیه مناسب سلول های درون بافت استفاده ی چندانی ندارد. وتنها جهت گذاری بافت در مدت زمان کوتاه استفاده می شود. برای رفع این مشکل ، بافت را می توان در سیستم های (بیوراکتورهایی) مثل بطری غلطان یا اسپین دار کشت داد.

کشت سلول اولیه (primary culture or explants culture) :

در این حالت سلول های جدا شده از بافت های بدن جنین یا جاندار زنده ، در ظرف کشت، کشت داده می شود به صورتی که کاملا در محیط کشت قرار گیرند. این نوع کشت به نام کشت اولیه انجام می گیرد.

کشت سلول جدا شده (Dissociated all culture ) :

در این روش کشت ، سلول های جدا شده به صورت تکه لایه روی سطح جامد رشد می نمایند. این نوع کشت بیشتر درآزمایشگاه های تحقیقاتی انجام می شود و نوع معمول کشت سلول است.

 organotypic culture :

هم کشتی دو یا چند نوع سلول در کنار یکدیگر را گویند

چهار نوع عمده کشت سلول ، ٬ انجمن بیوتکنولوژی ٬ بیوتکنولوژی ٬ ارشد بیوتکنولوژی ٬ دکترای بیوتکنولوژی ٬ بازار کار بیوتکنولوژی ٬ بیوتکنولوژی حیوانات ٬ بیوتکنولوژی دارویی ٬ رتبه لازم برای بیوتکنولوژی ٬ بیوتکنولوژی دانشگاه تهران ٬ بیوتکنولوژی مهندسی شیمی ٬ بیوتکنولوژی میکروبی ٬ بیوتکنولوژی پزشکی ٬ بیوتکنولوژی چیست ٬ بیوتکنولوژی گیاهی٬ زیست فناوری ٬ زیست فن آوری ٬ مهندسی علوم زیستی ٬ دانشگاه تهران ٬ کارنامه ارشد بیوتکنولوژی پزشکی ٬ کریسپر ٬ متاژنومیکس ٬ بیومارکر ٬ تراریخته ٬ ترانس ژنیک ٬ ترانسژنیک٬ اینستاگرام بیوتکنولوژی٬ کانال تلگرامی بیوتکنولوژی٬ گروه تلگرامی بیوتکنولوژی ٬ کانال بیوتکنولوژی دانشگاه تهران ٬ فلورسنس ٬ فلوسایتومتری ٬ مهندسی ژنتیک ٬ میکروارگانیسم ٬ میکروبیوم ٬ پیگمنت ٬ ژن درمانی ٬ ژن گزارشگر ٬ فلورسنت ٬ باکتری٬ آنتی بادی منوکلونال ٬ آلزایمر٬ سرطان ٬ ترانسژنیک ٬ ابریشم ٬ پروموتور ٬ حشرات سایبورگ ٬ بیونیک سنتتیک بیولوژی ٬ CRISPR، crispr چیست؟، pre-crRNA، spacer، تکنیک کریسپر، روش crispr، ساختار ژنی کریسپر، سیستم CRISPR/Cas، سیستم ویرایش ژنومی کریسپر/Cas، فناوری کریسپر، کریسپر، کریسپر pdf، کریسپر چیست؟، کریسپر+ppt، کمپلکس Cas، مکانیسم کریسپر، نقش سیستم کریسپر/Casدر باکتری ٬ بیوتکنولوژی دانش آموزی

چهار نوع عمده کشت سلول

نویسنده : سعید کارگر

عضویت در کانال تلگرامی بیوتکنولوژی

 

سیستم ویرایش ژنومی کریسپر/Cas

سیستم ویرایش ژنومی کریسپر | مکانیسم کریسپر | تکنیک کریسپر

باکتری ها روش های مختلفی برای مقابله با هجوم ویروس ها دارند، از جمله : جلوگیری از اتصال ویروس ها تا جلوگیری از ورود DNA آن ها.

باکتری ها روش های مختلفی برای مقابله با هجوم ویروس ها دارند، از جمله : جلوگیری از اتصال ویروس ها تا جلوگیری از ورود DNA آن ها.

 

در این دهه اخیر ، دانشمندان یک سیستم ایمنی جدید در باکتری را کشف کردند ، که به باکتری این امکان را می دهد که:
1) از ورود DNA خارجی به ژنوم خود جلوگیری کند
2) همچنین DNAهای مهاجم را مورد هدف قرار داده و آن ها را تخریب بکند.

 

این سیستم اولین بار در سال 1987 کشف شد هنگامی که nakata و همکارانش داشتن بر روی آنزیم iap مطالعه می کردند متوجه شدند که در پایین دست این ژن توالی های تکراری و غیر تکراری وجود دارد.

در سال 2002 بود که مشهده کردند این قسمت های تکراری به صورت پالیندرومی می باشند و همچنین به طور متناوب تکرار شده اند و به وسیله قسمت های غیر تکراری به نام spacer از هم جدا شده اند که اسم این نوع آرایش ژنی را CRISPR گذاشتند که مخفف Clustered Regular Interspaced short Palindromic Repeat می باشد.

این در حالی بود که هنوز عملکرد این سیستم مشخص نشده بود!

در عکس پایین می توانید ساختار ژنی کریسپر را مشاهده کنید

در عکس پایین می توانید ساختار ژنی کریسپر را مشاهده کنید

 

در سال 2005 بود Bolotin مشاهده کرد که ژن های Cas در مجاورت ساختار CRISPR وجود دارد. از آنجا که ژن های Cas یک DNA اندونوکلیاز را کد می کنند، این مشاهده به طور خیلی قوی نشان داد که تخریب DNA خارجی یکی از نقش های سیستم CRISPR/Cas می باشد.

پروتیین Cas9 دوتا جایگاه فعال برای برش رشته های DNA دارد به نام جایگاه های فعال HNH و RuvC1 که در DNA خارجی برش ایجاد می کند. - سیستم ویرایش ژنومی کریسپر/Cas

پروتیین Cas9 دوتا جایگاه فعال برای برش رشته های DNA دارد به نام جایگاه های فعال HNH و RuvC1 که در DNA خارجی برش ایجاد می کند.

نقش سیستم کریسپر/Casدر باکتری:

ایمنی که به وسیله کریسپر در باکتری ایجاد می شود از دو فاز اصلی تشکیل شده است:

1 ) فاز ایمنی سازی immunization
2) فاز ایمنی immunity

 

فاز ایمنی immunity :

در فاز ایمنی به دنبال آلوده باکتری با DNA خارجی ، رونویسی از ژن های سیستم CRISPR/Cas فعال می شود. از ژن های کریسپر یک mRNA نابالغ بنام pre-crRNA ساخته می شود. در بالا دست ژن کمپلکس Cas, توالی trans-activating crRNA وجود دارد که رونوشت این ژن نواحی با توالی تکراری pre-crRNA را شناسایی می کند و با آن ها مکمل می شود، به دنبال RNA polymerase III وارد عمل شده و یک برش ایجاد می کند و موجب تشکیل crRNA بالغ می شود.

در گام بعدی از روی ژن های کمپلکس cas هم پروتیین Cas9 ساخته می شود. سپس کمپلکس Cas9-crRNA-tracrRNA تشکیل می شود. که این کمپلکس لازم و ضروری برای هدف قرار دادن یا تخریب DNAخارجی می باشد.

 

فاز ایمن سازی immunization :

حال جای این سوال وجود دارد ، که اگر DNA فاژی وارد باکتری بشود و توالی crRNA برای شناسایی ژنوم فاژ وجود نداشته باشد آیا باز هم باکتری می تواند این DNA فاژی را شناسایی بکند؟

در هنگام مواجه با چنین DNA خارجی ، باکتری این بار از ژن های کمپلکس cas بجای اینکه پروتیین Cas9 را بسازد، پروتیین Cas1 و Cas2 را می سازد. این پروتیین بدون وجود RNA راهنما یا همان crRNA ، DNA خارجی را شناسایی می کند و آن را برش می دهد. سپس قسمتی از این DNA فاژی برش خورده در لوکوس کریسپر باکتری به عنوان واحدهایspacer قرار می گیرد. پس DNA موجود در نواحی spacer لوکوس کریسپر منشاء فاژی دارند.

بدین ترتیب با گذشت زمان مقدار ژن های این قسمت بیشتر می شود و باکتری هنگام مواجه دوباره با ژنوم این فاژ ، وارد فاز ایمنی کریسپر می شود.

 

 

برای اطلاعات کامل در مورد سیستم ویرایش ژنومی کریسپر/Cas به جزوه زیر مراجعه کنید:

تولید پروتئین بدون سلول

Cell-free protein synthesis

 

تولید پروتئین با استفاده از ماشین های بیولوژیکی و بدون استفاده از سلول های زنده در شرایط است. برای حفظ حیات سلولی دیواره سلولی یا شرایط هموستاز لازم است اجزای لازم برای این کار شامل عصاره سلولی، یک منبع انرژی، منبع اسیدهای آمینه، کوفاکتورها مانند منیزیم، و DNA با ژن مورد نظر است ، ماشین های سلولی لازم از جمله ریبوزوم ها، synthetases آمینواسیل-tRNA و عوامل شروع ترجمه و عوامل elongation ، و غیره می باشد.

تولید پروتئین بدون سلول

تولید پروتئین بدون سلول

واکنش CFPS دارای مزایای بسیاری برسنتز پروتئین در in vivo می باشد. در CFPS معمولا 1 -2 روز بیان پروتئین طول و عصاره گیری طول می کشد، در حالی که بیان پروتئین در in vivo ممکن است 1-2 هفته طول بکشد. این واکنش باز که دیواره سلولی اجازه می دهد تا دستکاری مستقیم با محیط شیمیایی انجام داد. نمونه می توان به راحت گرفته شود، غلظت بهینه سازی شود، و واکنش را می توان تحت نظارت داشت.

در مقابل، وقتی DNA به سلول زنده وارد می کنید به واکنش نمی توان دسترسی داشت تا زمانی که به پایان برسد و سلول ها لیز شوند. مزیت دیگر به CFPS عدم نگرانی برای سمیت است. برخی از پروتئین مورد دلخواه برای سلول سمی هستند از آنجا که سلول های زنده استفاده نمی شود، سمیت محصول پروتیینی معنی دار نیست. کاربرد اصلی CFPS وارد کردن اسیدهای آمینه غیر طبیعی به ساختارهای پروتئینی می باشد باز بودن این واکنش برای قرار دادن tRNA ها اصلاح شده و اسیدهای آمینه غیر طبیعی ایده ال می باشد.

 

سیستم های بیانی وابسته به سلول (in vivo) در طی سال های اخیر به طور گسترده ای به منظور تولید پروتیین ها، داروها و واکسن های نوترکیب مورد استفاده قرار گرفته اند، اما این سیستم های مزیت ها و محدودیت های مخصوص به خود را دارد از جمله محدودیت تولید پروتیین های سمی بوسیله سلول ها.

به همین دلیل رویکردهای جدیدی برای جبران محدودیت این سیستم ها معرفی شد که از بین آن ها می توان سیستم های بیانی عاری از سلول (cell free) را نام برد. استفاده از روش های ساخت پروتیین بدون سلول در هنگام مواجه با چالش های زیر ایده ال به نظر میرسد:

1⃣ هنگامی که محصول پروتیینی بیان شده برای سلول میزبان سمی است
2⃣ پروتیینی که در سلول میزبان تشکیل رسوبات بدون ساختار می دهد
3⃣ هنگامی که پروتیین تولیدی به سرعت در سلول تجزیه می شود.

از مزایای استفاده از سیستم های بیانی عاری از سلول می توان به انجام تغییرات پس از ترجمه، فولدینگ صحیح پروتیین ، حساسیت کمتر سیستم نسبت به سمیت پروتیین تولیدی و استراتژی های تولید با بازدهی بالا اشاره کرد.

🔘از لینک زیر هم می توانید کتاب لاتین cell free protein synthesis رو دانلود کنید:

https://telegram.me/biotechnology1/143

 

متاژنومیکس

متاژنومیکس

متاژنومیکس

متاژنومیکس

روش جامع تر در مطالعه ی مولکولی اجتماعات میکروبی ژنومیک محیطی است که متاژنومیک نیز نامیده می شود. متاژنومیک از توالی یابی و آنالیز تمام ژنوم های میکروبی درمحیطی ویژه به منظور مشخص کردن کل محتوای ژنتیکی آن محیط استفاده می شود.

مطالعه ی متاژنومیک اولیه از پروکاریوت ها در دریای sargaso تنوع قابل توجی را نمایان ساخت. این مطالعه براساس آنالیز حدود یک ملیارد جفت باز DNA به دست آمده از آب سطحی بود که نتایج پیشنهاد کردند که حداقل 2800 گونه باکتریایی و آرکیایی، از جمله 148 فیلوتیپ که قبلا شناسایی نشده بودند و بسیاری ژن های جدید وجود دارند.